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許多表達(dá)載體可能沒(méi)有能夠克隆標(biāo)記物的合適的限制性酶切位點(diǎn)。在這種情況下，采用PCR技術(shù)將多肽標(biāo)記物插入到已經(jīng)克隆化的開放閱讀框。在設(shè)計(jì)PCR正向和反向引物時(shí)，可引入較長(zhǎng)的片段以在蛋白的氨基或羧基末端引入多肽標(biāo)記物。，選擇用于編碼標(biāo)記物特定氨基酸的密碼子，使其能夠用于表達(dá)標(biāo)記蛋白的生物系統(tǒng)中。引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)加入新的限制性酶切位點(diǎn)，以便PCR產(chǎn)物的克隆。應(yīng)在引物限制性部位5，端添加額外的堿基，這些“增添”的堿基有利于限制酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行有效的切割。同時(shí)需注意保持正確的閱讀框和根據(jù)需求設(shè)計(jì)起始密碼和終止密碼子。使用Kozak的保守翻譯起始序列5，—CCACCATGG-3’代替單一的ATG起始密碼，可在真核細(xì)胞中進(jìn)行有效的翻譯。稍為復(fù)雜的PCR程序可以將肽標(biāo)記物為一個(gè)閱讀框內(nèi)融合蛋白形式，插入到開放閱讀框的任何一個(gè)部位。這些技術(shù)在許多克隆手冊(cè)中均有描述，在此僅給出一個(gè)簡(jiǎn)單的例子以說(shuō)明應(yīng)考慮的因素。
舉例：采用PCR技術(shù)將HA標(biāo)記物插入到周期素（cyclin）結(jié)合蛋白的氨基末端并在正。coli中表達(dá)
設(shè)計(jì)PCR的正向引物（氨基末端HA標(biāo)記物）有3個(gè)目的：
（1）編碼HA標(biāo)記物；
（2）與周期素結(jié)合蛋白YFP2開放閱讀框的5，端雜交；
（3）創(chuàng)建新的限制性酶切位點(diǎn)以便將編碼新的標(biāo)記蛋白的PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體中。
當(dāng)標(biāo)記氨基末端時(shí)，需要?jiǎng)?chuàng)建一個(gè)新的起始甲硫氨酸以避免破壞正確的翻譯起始信號(hào)。如果克隆到真核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，則需在此處引入Kozak保守序列，在本例選用（pET-）作為表達(dá)質(zhì)粒。
1．表位標(biāo)記物的序列
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
Y P Y D V P D Y A
選擇E．coli和人類常用的密碼子。
TAC CCA TAC GAC GTG CCA GAC TAC GCT
選擇一段重疊序列，將標(biāo)記物置于YFP2的氨基末端。通常有18～21bp的重疊序列即可。希望Tm溫度在55～80℃之間，盡可能避免連續(xù)3個(gè)C或G，且避免引物在3，端互補(bǔ)或者具有明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)?？墒褂密浖绦蜻M(jìn)行正確的引物設(shè)計(jì)。但是，一個(gè)簡(jiǎn)單的經(jīng)驗(yàn)是，每對(duì)AT提供2℃熔鏈溫度，而每對(duì)GC提供4℃熔鏈溫度。
2．YFP2的氨基末端
ATG GAC CCG GCG GCG GGG AGC
M D P A A G S
然后再創(chuàng)建限制性酶切位點(diǎn)。在本例中，所創(chuàng)建的位點(diǎn)并不在開放閱讀框中：本例選擇創(chuàng)建一個(gè)NdeI酶切位點(diǎn)，以編碼起始甲硫氨酸和有利于克隆到表達(dá)載體中。同時(shí)，添加GC以利于對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行有效的限制性消化和防止PCR產(chǎn)物末端的破裂。
GC CATATG
結(jié)合上述要素，設(shè)計(jì)正向引物，預(yù)定以下寡核苷酸
5，—GC CATATGTAC CCA TAC GAC GTG CCA GAC TAC GCT ATG GAC CCG GCG GCG GGGAGC-3，
反向引物可設(shè)計(jì)成為開放閱讀框的末端引物，并創(chuàng)建一個(gè)適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)。
3．YFP2在羧基端的序列
GGT CCC TCA GAC ATC CCC GAT TGA
G P S D I P D x
4．因與基因的該區(qū)域雜交并創(chuàng)建一個(gè)在片段另一端進(jìn)行克隆所需EcoRI酶切位點(diǎn)的反向引物
GC GAA TTC TCAATC GGG GAT GTC TGA GGG ACC
為使用現(xiàn)有的編碼YFP2基因的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR，需要根據(jù)所使用的具體設(shè)備，仔細(xì)地進(jìn)行優(yōu)化，以設(shè)計(jì)合適的反應(yīng)條件；這些優(yōu)化程序可以參見Dieffenbach和Dveksler（1995）的文獻(xiàn)。
如果得到大小正確的產(chǎn)物，就可將產(chǎn)物從凝膠中切下，使用PCRprepDNA純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，然后以EcoRI和NdeI進(jìn)行限制性消化，并連接到經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理的載體上去。在本例中，克隆到可在正．coli中表達(dá)的且含有合適酶切位點(diǎn)的pET-載體上。NdeI部位提供了起始甲硫氨酸。
5．新的氨基端
M Y P Y D V P D Y A M D P A A G S。。。
|————一標(biāo)記物——一|——YFP2——
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