細(xì)胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動(dòng)物體內(nèi)的組織（或器官）取出，模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)．使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細(xì)胞的生長、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過程的生命現(xiàn)象。

細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點(diǎn)，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對(duì)細(xì)胞生長發(fā)育和分化等的影響；二是細(xì)胞培養(yǎng)便于人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞骨架等）、細(xì)胞生長及發(fā)育等過程的觀察。因而細(xì)胞培養(yǎng)是探索和指示細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的—種簡便易行的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時(shí)我們也不可忽略的另一個(gè)因素，那就是它脫離樂生物機(jī)體后的—些變化。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等

為此有必要使學(xué)生在細(xì)胞培養(yǎng)方面得到一些初步的感性知識(shí)，了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作過程，觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長特征，對(duì)原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞有一個(gè)基本概念。

本實(shí)驗(yàn)分兩次進(jìn)行．即清洗與消毒和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察。

Ⅰ清洗與滅菌

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?span lang="EN-US">

能獨(dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的*步，是組織培養(yǎng)中工作量zui大，也是zui基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對(duì)清潔和無菌的要求程度很高。細(xì)胞養(yǎng)不好與清洗不*有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，哪怕殘留0．1個(gè)，也可能影響細(xì)胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對(duì)不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對(duì)，即使達(dá)到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性或其他使用價(jià)值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。

三、實(shí)驗(yàn)材料、用品

材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜（直徑25）：孔徑為0．22μm，微孔濾膜（直徑90）：孔徑為0．22 μm，過濾器（直徑25）。

藥品：70％或75％酒精，0．1％新潔爾滅，煤酚皂溶液（來蘇兒水），0．5％過氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸（工業(yè)），DEPC水[體積分?jǐn)?shù)0．1％的焦炭酸二乙酯（diethylpyroearbonate）]。

儀器：超凈臺(tái)，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）清洗

1．新玻璃器皿的清洗先用自來水刷洗，再浸泡5％稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和其他有害物質(zhì)。

2．使用過的玻璃器皿的清洗

（1）使用過的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸入清水，避免干涸難洗。

（2）用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥。

（3）浸酸性洗液過夜。

（4）從酸性洗液撈出后自來水沖洗10．15次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，倒置烘干。

（5）包裝（牛皮紙或一般紙）。

（6）高壓（15磅20 min）或干熱（170℃2 h）滅菌。

（7）貯存?zhèn)溆谩?span lang="EN-US">

3．膠塞的處理

（1）新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20 min。

（2）自來水清洗10次。

（3）再用1％稀鹽酸浸泡30 min。

（4）自來水清洗10次，蒸餾水涮洗3次。晾干，高壓滅菌（見（二）消毒與滅菌）。舊膠塞不*酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。

（二）消毒

1．物理消毒法

（1）紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺(tái)面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。

（2）干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱至160℃，保溫90－120 min。用于RNA提取實(shí)驗(yàn)的用品則需180℃，保溫5－8 h。

（3）濕熱滅菌 此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是zui有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類、橡膠制品（如膠塞）、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機(jī)溶液（如Hanks液、PBS、20×SSC等）。手動(dòng)高壓滅菌鍋操作如下：

①首先查看高壓鍋內(nèi)的水是否充足，放人物品蓋好蓋。

②加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣5—10 min，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。

③待鍋內(nèi)水沸騰后，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅（121℃）30 min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅（115 ℃）20 min。調(diào)節(jié)火力大小保持該壓力。

④停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。

電熱自動(dòng)滅菌鍋使用說明（型號(hào)：SANYO Autoclave MLS-3020）：

①放氣筒加水至LOW水平線處，將與高壓鍋相連的導(dǎo)氣管插入放氣筒里，然后將放氣筒歸于原位。

②打開高壓鍋蓋，加入蒸餾水至高壓鍋底的水位線，水位線位于V型凹槽的1／3－2／3處。

③打開電源。

④設(shè)定高壓溫度及時(shí)間，高壓鍋的溫度范圍為105－121℃，高壓滅菌一般采用121℃20—30 min。

⑤把待高壓的物品置于高壓鍋內(nèi)，順時(shí)針方向?qū)?span lang="EN-US">exhaust鈕旋至close位置。

⑥關(guān)閉高壓鍋蓋，旋至顯示屏上左上角的紅亮點(diǎn)剛出現(xiàn)為止。

⑦按start鈕，開始高壓，在溫度達(dá)80℃時(shí)顯示器開始顯示溫度，當(dāng)溫度達(dá)到所需的設(shè)定溫度時(shí)，在顯示屏的左下角有一長形的指示燈閃亮，直到高壓時(shí)間結(jié)束后指示燈滅，此時(shí)蜂鳴器報(bào)警一聲。當(dāng)壓力降至0 MPa時(shí)，蜂鳴器再報(bào)警一聲。溫度降至80℃時(shí)，蜂鳴器報(bào)警10次。顯示屏溫度指示消失，此時(shí)才可打開鍋蓋。

⑧關(guān)電源，開高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品，烘干。

（4）濾過除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號(hào)按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號(hào)的金屬濾器（直徑90 mm、100 mm、142 mm……等），配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動(dòng)的塑料小濾器（直徑20 mm、25 mm等）。濾膜孔徑有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌zui為保險(xiǎn)，但對(duì)于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。

①在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0．22μm。

②用布包好，濕熱滅菌后使用。

2．化學(xué)消毒法

常用的消毒液有如下幾種：

（1）70％（或75％）酒精：超凈臺(tái)里常備70％酒精棉球（衛(wèi)生級(jí)酒精），用于手和一些金屬器械或工作臺(tái)面的消毒。

（2）0．1％新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺(tái)面的清潔。超凈臺(tái)旁應(yīng)常備盛有0．1％新潔爾滅溶液的容器及紗布。

（3）來蘇兒水（煤酚皂溶液）：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細(xì)胞的消毒處理。使用濃度請(qǐng)按瓶上說明。

（4）0．5％過氧乙酸：是強(qiáng)效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進(jìn)行。

（5）乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門窗緊閉1—3 d?？蓪⒖諝庵衅〉奈⑸餁⑺?。

（6）37％甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37％甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3 d后方可達(dá)到消毒空氣的目的。

3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。

五、注意事項(xiàng)

1．清洗玻璃制品時(shí)，浸酸之后一定要用自來水沖洗10—15次。因?yàn)闅埓娴南匆簩?duì)細(xì)胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時(shí)要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細(xì)胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個(gè)清洗。如沒有洗凈會(huì)影響下一次使用的效果。

2．干熱滅菌時(shí)，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當(dāng)溫度超過100℃時(shí)，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。．

3．高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。

4．牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機(jī)溶液，均不能高壓（如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等）。

5．濾過除菌時(shí)，濾器在使用前先裝好濾膜（有時(shí)可在上面加一層定性濾紙），包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時(shí)應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進(jìn)行。過濾時(shí)壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時(shí)微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時(shí)位置要準(zhǔn)確。另外濾器包裝時(shí)，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進(jìn)入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。

6．使用化學(xué)消毒法時(shí)，配制75％酒精應(yīng)用衛(wèi)生級(jí)，不要用化學(xué)純、分析純和純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對(duì)皮膚有刺激性。空氣消毒時(shí)，所有的物品要事先準(zhǔn)備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因?yàn)榧兹┗蛉樗峒訜岷蠓懦龅恼魵鈱?duì)人的角膜和呼吸道上皮有嚴(yán)重的刺激和傷害作用。

六、思考題

1．哪些物品適合于高壓滅菌，并說明理由。

2．紫外線消毒的適用范圍和目的是什么?

II、傳代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

了解傳代細(xì)胞的傳代方法及操作過程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況

二、實(shí)驗(yàn)原理

傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。

這種培養(yǎng)，*步也是制備細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞長成致密單層時(shí)，它很容易被蛋白水解酶和EDTA）所破壞。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA（乙二胺四乙酸鹽）的混合物，做為消化液。

細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。

三、實(shí)驗(yàn)用品

1、器材

解剖剪、解剖鑷、眼科剪（尖頭、彎頭）、眼科鑷（尖頭、彎頭）、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶（小方瓶或中方瓶）等。上述器材均須*清洗、烤干、包裝好，9．9xl0⁴Pa（15磅）滅菌30min備用。

此外，還有顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標(biāo)記筆、解剖板等。

2、試劑

L磷酸鹽緩沖液（PBs）

無鈣、鎂溶液

細(xì)胞消化液：o．5％胰蛋白酶和o．4%EDTA

EMEM液

3%谷氨酰胺

o．5％臺(tái)盤藍(lán)染液等

3、材料

喉癌細(xì)胞

四、實(shí)驗(yàn)方法

在做傳代細(xì)胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞是否已長成致密單層，如已長成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。

1.營養(yǎng)液配制:

EMEM液                                90%

犢牛血清                              10%

雙抗（1萬單位／m1）               加至約100單位／m1

3％谷氛酞胺                           1m1

7．4％NaHCO₃                    調(diào)pH至6．8—7．0

2．換液:

在酒精燈旁打開瓶塞，倒去瓶中的細(xì)胞營養(yǎng)液。

3.消化與分裝

在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動(dòng)，將溶液倒出。重復(fù)上述動(dòng)作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml十o．5％胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細(xì)胞為宜，置于室溫，停留1—2min后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，肉眼觀察細(xì)胞單層是否出現(xiàn)縫隙（針孔大小的空隙），如出現(xiàn)縫隙，即可倒去消化液；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，繼續(xù)進(jìn)行消化，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時(shí)，可倒去消化液，加入新配制的營養(yǎng)液20m1。然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞層至瓶壁細(xì)胞全部脫落下來為止。此時(shí)，可繼續(xù)輕輕地吹打細(xì)胞懸液，以使細(xì)胞散開。隨之進(jìn)行分裝。

4．培養(yǎng)

分裝好的細(xì)胞瓶上，做好標(biāo)志，注明細(xì)胞代號(hào)、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細(xì)胞均勻分布，以免堆積成團(tuán)。然后置于37℃培養(yǎng)。

5.觀察

（1）觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的幾個(gè)問題；

細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行觀察，觀察的重點(diǎn)如下：

A.首先要觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度

B.觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細(xì)胞是否生長。

C.如細(xì)胞已生長，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段。觀察時(shí)可參照（2）的描述進(jìn)行。

D．觀察完畢，可用臺(tái)盤藍(lán)染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。以確定死、活細(xì)胞的比例。

（2）細(xì)胞的生長階段及其形態(tài)特征

傳代培養(yǎng)的細(xì)胞需逐日進(jìn)行觀察，注意細(xì)胞有無污染，培養(yǎng)液顏色的變化及細(xì)胞生長的情況。—般中層培養(yǎng)的細(xì)胞，從培養(yǎng)開始，經(jīng)過生長、繁殖、衰老及死亡的全過程。它是一個(gè)連續(xù)的生長過程，但為了觀察及描述，人為地將具分為5個(gè)時(shí)期，但各期間無明顯界限?，F(xiàn)分別描述如下：

A．游離期：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)消化分散成單個(gè)細(xì)胞后，由于細(xì)胞原生質(zhì)的收縮相表面張力以及細(xì)胞膜的彈性。所以，此時(shí)細(xì)胞多為圓形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)h。

B．吸附期（貼壁）：由于細(xì)胞的附壁持性，細(xì)胞懸液靜置培養(yǎng)一段時(shí)間（約7—8h）后，便附著在瓶壁上（此期不同細(xì)胞所需時(shí)間不同）。在顯微鏡下觀察時(shí)可見瓶壁上有各種形態(tài)的細(xì)胞，如圓形、扁形、短菱形。細(xì)胞的特點(diǎn)，大多立體感強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，透明。

C.繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h，細(xì)胞進(jìn)入繁殖期，加速了細(xì)胞生長和分裂。此期包括由幾個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞島（即由少數(shù)細(xì)胞緊密聚集而呈現(xiàn)的孤立細(xì)胞群，常散在地分布在瓶壁上），到細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶壁（即所謂形成細(xì)胞單層）的過程。此期細(xì)胞形態(tài)為多角形（呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞的特征）。細(xì)胞特點(diǎn)：透明，顆粒較少，細(xì)胞間界限清楚，并可隱約見到細(xì)胞核。根據(jù)細(xì)胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長狀況分為四級(jí)。以“十”的多少表示如下：

十：細(xì)胞占瓶壁有效面積（也就是細(xì)胞能生長的瓶壁面積）的25％以內(nèi)有新生細(xì)胞。一般要觀察3—5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞生長狀況，然后加以綜合分析判斷。

十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的25—75％以內(nèi)具新生細(xì)胞。

十十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的75—95％具新生細(xì)胞。細(xì)胞排列致密。但仍有空隙。

十十十十：細(xì)胞占瓶壁95％以上，細(xì)胞已長滿或接近長滿單層，細(xì)胞致密，透明度好。

從十十一十十十十為細(xì)胞的對(duì)數(shù)增長期（或稱為指數(shù)增長期）。

D．維持期：當(dāng)細(xì)胞形成良好單層后，細(xì)胞的生長與分裂都減緩，并逐漸停止生長，這種現(xiàn)象被稱為細(xì)胞生長的接觸抑制。此時(shí)細(xì)胞界限逐漸模糊，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積累，維持液逐漸變酸。此時(shí)營養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色。

E．衰退期：由于溶液中營養(yǎng)的減少和日齡的增長，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素，此時(shí)細(xì)胞間可出現(xiàn)空隙，細(xì)胞中顆粒進(jìn)一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細(xì)胞經(jīng)固定染色處理后，可見細(xì)胞中有大而多的脂肪滴及液泡。zui后，細(xì)胞皺縮，逐漸死亡，從瓶壁上脫落下來。

五、思 考 題

1．簡述細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作程序及注意鄉(xiāng)項(xiàng)。

3．細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵要素是什么?

3．簡述體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征及其生長階段。

實(shí)驗(yàn)二 植物細(xì)胞組織培養(yǎng)

一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的技術(shù)性強(qiáng)，要求無菌操作，通過本實(shí)驗(yàn)可初步掌握常規(guī)的組織培養(yǎng)技術(shù)，加深對(duì)無菌操作的了解。

 二．實(shí)驗(yàn)原理

植物的性：植物體的任何一個(gè)細(xì)胞都具有生長分化成為一個(gè)完整植株的能力，稱為植物的性。

植物組織培養(yǎng)就是利用植物的性進(jìn)行離體無菌植物培養(yǎng)的一門技術(shù)。植物組織培養(yǎng)按其原始意義，就是指愈傷組織培養(yǎng)。但發(fā)展至今，其范圍日益擴(kuò)大，已包括植物和它的離體器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體的離體無菌培養(yǎng)。因此，擁有幾種不同水平的培養(yǎng)技術(shù)，即整體的、器官的、組織的、細(xì)胞的和原生質(zhì)的培養(yǎng)技術(shù)。

     本實(shí)驗(yàn)選擇豌豆為材料，豌豆（Pisum sativum）屬豆科植物，是糧食、飼料和重要的蔬菜作物，也是遺傳學(xué)家和植物生理學(xué)家感興趣和樂于采用的實(shí)驗(yàn)植物，豌豆的根、莖、子葉、下胚軸、上胚軸、花芽等外植體，皆可形成愈傷組織，其中莖尖、幼胚、幼葉等器官可成功的再生成植株。莖尖培養(yǎng)可包括小至十幾微米的莖尖分生組織（生長點(diǎn)）和大至幾十毫米的莖尖或更大的芽培養(yǎng)。在實(shí)踐應(yīng)用上，常采用生長點(diǎn)的培養(yǎng)使患病植物去病毒，以達(dá)到挽救優(yōu)良品種，提高產(chǎn)量和質(zhì)量之目的。

 三．實(shí)驗(yàn)材料

儀器設(shè)備：1．酒精燈、三角燒瓶，培養(yǎng)皿；2．鑷子、剪刀、剖針；3．雙筒解剖顯微鏡；4．光照培養(yǎng)箱或溫室；

材料  煙草無菌苗、豌豆幼苗。

試劑

（1）MS培養(yǎng)基，植物激素：NAA、6-BA等；

（2）飽和漂白粉液（次氯酸鈉）；

（3）70%酒精、100%酒精、酒精棉球；

（4）無菌水 

四．實(shí)驗(yàn)步驟

豌豆苗的莖尖培養(yǎng)

 ⑴ 取發(fā)芽6天的豌豆幼苗10株，簡取1厘米左右的莖尖，浸入70%的酒精中1分鐘，再浸入飽和次氯酸鈉溶液中消毒15分鐘，（此步以后要求無菌）用無菌水中沖洗5次，在滅菌的濾紙上吸干水分，放入滅菌的培養(yǎng)皿中。

⑵ 在雙目解剖鏡下，用滅菌的解剖針剝?nèi)ビ兹~露出生長錐，用滅菌的解剖針挑取帶著兩至三個(gè)葉原基的生長錐。

⑶ 將挑好的莖尖移到MS+10.7μmol/L萘乙酸（NAA）+4.4μmol/L 6-芐基腺嘌呤（6-BA）的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織形成，用封口膜將培養(yǎng)皿封好。

（4）在恒溫培養(yǎng)箱中，26℃下,培養(yǎng)六周，形成愈傷組織，經(jīng)繼代后，可用于生根培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)三 酵母菌細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?span lang="EN-US">

學(xué)習(xí)酵母菌原生質(zhì)體制備和再生技術(shù)，為了解酵母菌為材料的外源基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

酵母菌如釀酒酵母，在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究中有很大作用，尤其是近些年來，隨著科技的進(jìn)步，酵母菌的遺傳操作如轉(zhuǎn)化、基因克隆和外源基因在酵母受體中的表達(dá)等技術(shù)都有了突破性的進(jìn)展。作為受體系統(tǒng)的酵母菌原生質(zhì)體在這些技術(shù)中有*的地位。這種經(jīng)溶菌酶處理脫壁后的細(xì)胞（脫壁不*者稱原生質(zhì)球）既可以作為不同種屬間細(xì)胞融合的母體，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器等大結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)移，又可作為外源基因轉(zhuǎn)移的受體，大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率。這些新技術(shù)不僅促進(jìn)了酵母菌遺傳學(xué)的發(fā)展，而且很多已應(yīng)用到構(gòu)建新的釀酒業(yè)酵母。

本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母為材料，進(jìn)行原生質(zhì)體的分離制備和再生。酵母菌原生質(zhì)體的制備一般采用蝸牛酶、酵母溶菌酶或其它細(xì)胞壁溶解酶類。分離制備過程受許多因素的影響，如不同菌株的生長期、細(xì)胞濃度、溶菌酶類型和用量、處理時(shí)間和溫度等。所以整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程設(shè)計(jì)應(yīng)綜合考慮各種因素，才能獲得較好的效果。分離制備的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)脑偕囵B(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，可以再生出細(xì)胞壁而恢復(fù)完整細(xì)胞狀態(tài)，即完成再生過程，這也是以原生質(zhì)體為受體的所有實(shí)驗(yàn)技術(shù)zui終能實(shí)現(xiàn)的一個(gè)關(guān)鍵步驟。

在原生質(zhì)體制備中，應(yīng)選用適當(dāng)生長時(shí)期的菌體作為分離的材料。一般來說，對(duì)數(shù)生長期的酵母菌細(xì)胞易脫壁，靜止期細(xì)胞較難甚至不可能形成原生質(zhì)體。而不同菌種的生長對(duì)數(shù)期也略有差異，一般在12～16小時(shí)之間（10⁸細(xì)胞/ml）。制成的原生質(zhì)體懸浮液在0℃條件下保存4～6小時(shí)，不會(huì)影響融合再生率。所以欲進(jìn)行原生質(zhì)體融合，應(yīng)在制備后盡快進(jìn)行，以免時(shí)間過長，影響再生。

分離過程中采用的β-巰基乙醇可使細(xì)胞壁組分中的二硫鍵破壞，使蝸牛酶易于分解細(xì)胞壁。此外，滲透壓的調(diào)節(jié)可用0.8mol/L山梨醇、16％蔗糖，或者0.6mol/L KCl溶液。

三、實(shí)驗(yàn)材料

菌種：釀酒酵母SP-48、L-酵母：　　

器具和試劑：

恒溫?fù)u床、恒溫水浴、顯微鏡、臺(tái)式離心機(jī)、培養(yǎng)皿、試管、過濾滅菌裝置。

液體YEPD：1000 ml 分裝四瓶（蛋白胨 2%  葡萄糖 2%  酵母浸膏 1%  自然pH 值）

高滲YEPDS：1000 ml （加入  kcl  52.5 g）  YEPD 液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂

PB：2000 ml                                                                                                                                                                                 

 檸檬酸：21克溶于1000毫升蒸餾水中   磷酸氫二鈉：143.256克溶于2000毫升蒸餾水中 

        取檸檬酸溶液678毫升 取磷酸氫二鈉溶液1322毫升 混合得2000毫升PB

高滲PB：取1000毫升PB加入KCL52.185克

PEG-CaCl：聚乙二醇6000  40克 加入至100毫升高滲PB溶液中 使氯化鈣為0.4mol/l

0.2%β-巰基乙醇，無菌過濾器過濾.

蝸牛酶液:1.5% 蝸牛酶用高滲PB緩沖溶液配制，無菌過濾器過濾.

淀粉YEPDS：1000 ml （加入  kcl  52.5 g）  YEPD 液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂（蛋白胨 2%  淀粉 2%  酵母浸膏 1%  自然pH 值）

四、實(shí)驗(yàn)步驟

　　整個(gè)分離制備和再生過程于無菌條件下操作。

1.原生質(zhì)體的制備:

（1）   菌種培養(yǎng):將酵母菌sp-48和L-酵母活化轉(zhuǎn)接新鮮斜面.自新鮮斜面分別挑取一環(huán)sp-48酵母和L-酵母轉(zhuǎn)接入250ml*培養(yǎng)基中,30℃振蕩培養(yǎng)16-18h.

（2）   收集細(xì)胞：取上述對(duì)數(shù)生長期的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液5ml,4000r/min離心10min，棄上清液.檸檬酸-磷酸緩沖液（PB）洗兩次，收集菌體

（3）   預(yù)處理：取5ml0.2%β-巰基乙醇PB緩沖液于裝有酵母泥的離心管中,30℃保溫10min,以1000轉(zhuǎn)/分離心10min,傾去上清液

（4）   脫壁：在裝有處理過的SP－48,L-酵母菌泥的兩只離心管中，分別加入5ml 1.5%蝸牛酶-PB溶液置30℃水浴中處理,取樣鏡檢,當(dāng) 80%以上的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體 2500r/min離心10min,用PB液離心洗滌，洗去酶液，加入4ml高滲PB液制成10⁶/ml以上的原生質(zhì)體液,測定形成率

原生質(zhì)體形成率=（酶解前菌落計(jì)數(shù)-未形成原生質(zhì)體菌數(shù)）/ 酶解前菌落計(jì)數(shù)×100%

2.原生質(zhì)體再生率測定 :

 將制備的原生質(zhì)體稀釋到2-3×10⁷個(gè)/ml,各取1ml原生質(zhì)體液用PB液稀釋后涂布在高滲*培養(yǎng)基（YEPDS）和*培養(yǎng)基（YEPD）.30℃培養(yǎng)2天計(jì)算菌落數(shù),酶解前的菌液直接用無菌水稀釋涂布*培養(yǎng)基，培養(yǎng)后計(jì)算菌數(shù)。

原生質(zhì)體再生率％＝

3.原生質(zhì)體的融合:

（1）. 將L-酵母的原生質(zhì)體用紫外線滅活2分鐘,在黑暗中保存20分鐘, 2500rad/min離心10min,用2ml高緩沖液懸浮.

（2）. 將兩菌的原生質(zhì)體懸浮液混合,離心,向沉淀中加入3mlPEG-CaCl₂,振蕩均勻, 30℃處理20min, 鏡檢并觀察融合情況.

（3）. 用高深緩沖液洗滌菌體沉淀, 2500rad/min離心10min.

（4）. 立即用高深緩沖液稀釋,取融合原菌液及10^-1稀釋液各0.1ml菌液,涂布于再生培養(yǎng)基平板上.

4.融合子的檢出:

 將融合液涂布在加有0.01%的放線菌酮和青霉素（100IU/ml）的再生培養(yǎng)基上,30℃進(jìn)行培養(yǎng)2天,計(jì)算融合率.   

融合率= ×100%

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.融合子的鑒定 : 觀察比較兩親株和融合子的細(xì)胞形態(tài)

2..計(jì)算兩親本原生質(zhì)體的形成率和再生率

3.計(jì)算融合率