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Western blot發(fā)光檢測(cè)中常見(jiàn)的問(wèn)題及解決方法

來(lái)源:愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司   2017年03月27日 09:28  
 免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法,被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的研究、抗體活性檢測(cè)和早期疾病診斷等多個(gè)方面。其中較為簡(jiǎn)單也為大家所普遍接受的Western blot顯色方法為底物化學(xué)發(fā)光法ECL。

 

*,Western blot的原理是蛋白質(zhì)在電力場(chǎng)的作用下,由大到小的進(jìn)行排列,利用電泳進(jìn)行分離和富集。擁有抗原表位的蛋白質(zhì)分子被抗體(一抗)特異性識(shí)別并與之結(jié)合。在此基礎(chǔ)上,酶或熒光標(biāo)記的二抗識(shí)別并結(jié)合一抗,通過(guò)與底物反應(yīng)顯色來(lái)觀察目的蛋白。
 
Western blot顯色的方法主要有以下幾種:
     一、放射自顯影;
     二、 底物化學(xué)發(fā)光ECL;
     三、底物熒光ECF;
     四、底物DAB呈色。
 
現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot顯色底物是化學(xué)發(fā)光底物,發(fā)表文章通常也是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。
 
ECL法檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的原理是辣根過(guò)氧化物酶在H2O2存在下,氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾(lumino,氨基苯二酰一肼)并發(fā)光,在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大1000倍,通過(guò)將印記放在照相底片上感光就可以檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的存在。ECL法操作簡(jiǎn)便,應(yīng)用現(xiàn)成的試劑盒(abs920),按照說(shuō)明,將兩種顯色底物等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻,用玻璃膠片把膜包起來(lái),馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面,顯影、定影(或用熒光檢測(cè)儀檢測(cè))。ECL法具有靈敏度高,線性范圍廣等特點(diǎn)。

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