基因診斷的概念
一、基本概念:
1.人類的絕大多數(shù)疾病都與基因有關(guān),基因變異引起疾病兩種類型:
1) 內(nèi)源基因變異:由于先天遺傳和后天內(nèi)外環(huán)境因素的影響,人類的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)的各個(gè)環(huán)節(jié)都可發(fā)生異常,從而導(dǎo)致疾病。分基因結(jié)構(gòu)突變和表達(dá)異常。
2) 外源基因的入侵:各種病原體感染人體后,其特異的基因被帶入人體并在體內(nèi)增殖引起各種疾病。基因改變引起各種表型改變,從而引起疾病,從基因水平探測分析病因和疾病的發(fā)病機(jī)制,并采用針對(duì)性的手段矯正疾病是近年基礎(chǔ)和臨床的方向。
2.基因診斷:利用現(xiàn)代生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法,直接檢測基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平是否正常,從而對(duì)疾病作出診斷的方法。
二、基因診斷的特點(diǎn):
1.以基因做檢查材料和檢查目標(biāo)針對(duì)性強(qiáng);
2.分子雜交選用特定基因序列作探針,故特異性強(qiáng);
3.分子雜交和PCR具有放大效應(yīng),故有較大的靈敏度;
4.適用性強(qiáng),診斷范圍廣。
基因診斷的常用技術(shù)
一、核酸分子雜交:
核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開,而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙鏈結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行,因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測樣品的不同又被分為DNA印跡雜交(Southern blot hybridization )和RNA印跡雜交(Northern blot hybridization)。
(一)核酸分子雜交的基本過程:
①.DNA或RNA的制備:將待測樣品用一定方法提取DNA或RNA。
②.制備探針;
③.雜交;
④.檢測。
1.DNA或RNA的制備:將待測樣品用一定方法提取DNA或RNA。
2.基因探針的概念:
① 基因探針(probe)就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列,它可以包括整個(gè)基因,也可以僅僅是/基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。
② 探針的來源:
DNA探針根據(jù)其來源有3種:一種來自基因組中有關(guān)的基因本身,稱為基因組探針(genomic probe);另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA,再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針,稱為cDNA探針(cDNA probe)。與基因組探針不同的是,cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。此外,還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA的片段,稱為寡核苷酸探針。
③ 探針的制備:
進(jìn)行分子突變需要大量的探針拷貝,后者一般是通過分子克?。╩olecular cloning)獲得的。克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個(gè)體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn),應(yīng)先制備基因組文庫,即把基因組DNA打斷,或用限制性酶作不*水解,得到許多大小不等的隨機(jī)片段,將這些片段體外重組到運(yùn)載體(噬菌體、質(zhì)粒等)中去,再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸桿菌,這時(shí)在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA的片段的克隆噬菌斑,通過原位雜交,從中可篩出含有目的基因片段的克隆,然后通過細(xì)胞擴(kuò)增,制備出大量的探針。
為了制備cDNA 探針,首先需分離純化相應(yīng)mRNA,這從含有大量mRNA的組織、細(xì)胞中比較容易做到,如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,就可以合成與之互補(bǔ)的DNA(即cDNA),cDNA與待測基因的編碼區(qū)有*相同的堿基順序,但內(nèi)含子已在加工過程中切除。
寡核苷酸探針是人工合成的,與已知基因DNA互補(bǔ)的,長度可從十幾到幾十個(gè)核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量,也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列,并用化學(xué)方法合成。
④ 探針的標(biāo)記:
為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交,有必要對(duì)探針加以標(biāo)記,以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào),通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體,熒光素等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是保存時(shí)間較長,而且避免了同位素的污染。常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法(nick translation)。
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