1．腫瘤細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164細(xì)胞的培養(yǎng)液（含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液），37℃ 5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3小時，讓細(xì)胞帖壁。

2．用RPMI-1640培養(yǎng)液10倍遞次稀釋TNF標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)需要3～5倍遞次稀釋待檢樣品，每孔加0.1ml稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品，每個稀釋度3個重復(fù)孔。對照孔6個，3個陽性對照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培養(yǎng)液，3個陰性對照孔各加100μl RPMI-1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)18～24小時。

3．甩去培養(yǎng)液，用PBS小心洗滌一次，每孔加0.1ml 10％甲醇溶液固定腫瘤細(xì)胞30秒鐘。

4．吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml結(jié)晶紫染液，室溫中放置20分鐘。

5．輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔，將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室溫中長期保存。

6．測定前，每孔加0.1ml 33％醋酸脫色，充分振蕩后在570nm處測定光吸收度。用光吸收度（OD）值對樣品稀釋度作圖，比較標(biāo)準(zhǔn)品曲線和待檢樣品曲線即可得到待測樣品中的腫瘤細(xì)胞因子活性。