流式細胞技術(shù)實驗方法

PI 染色操作步驟

1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。

2、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清。

3、加入2ml預(yù)冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定過夜。

4、離心，棄上清液。

5、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。

6、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，離心。

7、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。

8、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室溫避光孵育30min。

9、混勻，過300目篩網(wǎng)，置流式管中， 4℃冰箱保存，待測。

GFP PI染色操作步驟

1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。

2、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清。

3、加入2ml預(yù)冷PFA，PFA的濃度根據(jù)細胞的特點進行調(diào)節(jié)，4℃固定30min。 以下步驟同PI 染色操作步驟的（4-9）

細胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。

2、以冷PBA 1ml，離心洗滌，棄上清液。

3、加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200ul。用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min-1h。

4、離心棄上清液。

5、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。

6、向細胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測。

細胞表面間接免疫熒光染色操作步驟

1-2、同細胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

3、 用PBA稀釋的*抗體200ul，對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實驗動物IgG，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1、5-2h。離心，棄上清。

4、 PBS 1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。

5、 PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標記的第二抗體200ul。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min，避光。

6、 PBS 1ml離心洗滌2次。

7、將細胞重新懸浮于500ulPBS中，混勻，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待測。

胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟

1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500 rpm , 5 min，棄上清液。

2、用1×PBS 1 ml洗滌1次，離心。

3、4% PFA 1ml，4 ℃固定30min。

4、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。

5、0.1% Triton-100 1ml, 室溫10min。

6、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。

7、加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200ul，用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30 min-1h。

8、離心棄上清液。

9、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。

10、向細胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測。

胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟

1-6、同胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟

7、加入用PBA稀釋的*抗體200 ul，對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實驗動物IgG，輕輕吹打混勻，4 ℃或置冰上孵育1.5-2 h。離心，棄上清。

8、冷PBS 1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。

9、加入PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標記的第二抗體200 ul。吹打混勻，4 ℃或置冰上孵育30 min，避光。

10、冷PBA 1ml離心洗滌2次。

11、將細胞重新懸浮于500 ul PBS中，混勻，置流式管中，避光，4 ℃冰箱保存，待測。
備注：

1、 RNase A： 貯液濃度：1mg/ml ；

工作液配制：加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中，使終濃度為 20ug/ml。

2、PI： 貯液濃度：2.5mg/ml；

工作液配制： 加2、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中，使終濃度為 50ug/ml。

3、PBA ： 即PBS加1-2% 牛血清白蛋白，加0.1%疊氮鈉。

4、檢測樣品細胞濃度1x10 /ml。