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原子力激光共焦顯微鏡的主要原理是利用激光掃描束通過(guò)光柵針孔形成點(diǎn)光源，在熒光標(biāo)記標(biāo)本的焦平面上逐點(diǎn)掃描，采集點(diǎn)的光信號(hào)通過(guò)探測(cè)針孔到達(dá)光電倍增管，再經(jīng)過(guò)信號(hào)處理，在計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏上形成圖像。對(duì)于物鏡焦平面的焦點(diǎn)處發(fā)出的光在針孔處可以得到很好的會(huì)聚，可以全部通過(guò)針孔被探測(cè)器接收。而在焦平面上下位置發(fā)出的光在針孔處會(huì)產(chǎn)生直徑很大的光斑，對(duì)比針孔的直徑大小，則只有極少部分的光可以透過(guò)針孔被探測(cè)器接收。而且隨著距離物鏡焦平面的距離越大，樣品所產(chǎn)生的雜散光在針孔處的彌散斑就越大，能透過(guò)針孔的能量就越少，因而在探測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào)就越小，影響也越小。正由于共焦顯微僅對(duì)樣本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干擾，使得它具有比普通顯微鏡更高的分辨率，并在生物學(xué)中獲得了廣泛的應(yīng)用。
原子力激光共焦顯微鏡用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。
在結(jié)構(gòu)配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測(cè)器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、圖像輸出設(shè)備、光學(xué)裝置和共聚焦系統(tǒng)等部分。由于該儀器具有高分辨率、高靈敏度、“光學(xué)切片”、三維重建、動(dòng)態(tài)分析等優(yōu)點(diǎn)，因而為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的研究提供了有效手段。此外，CLSM 對(duì)熒光樣品的觀察具有明顯的優(yōu)勢(shì)，只要能用熒光探針進(jìn)行標(biāo)記的樣品就可用其觀察。
原子力激光共焦顯微鏡可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量, 配合焦點(diǎn)穩(wěn)定系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察。
在普通寬視野光學(xué)顯微鏡中，整個(gè)標(biāo)本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明，圖像可以用肉眼直接觀察。同時(shí)，來(lái)自焦點(diǎn)以外的其他區(qū)域的熒光對(duì)結(jié)構(gòu)的干擾較大，尤其是標(biāo)本的厚度在 2um 以上時(shí)，其影響更為明顯。
激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對(duì)標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡，通過(guò)探測(cè)針孔時(shí)先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管探測(cè)收集，并將信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)，處理后在計(jì)算機(jī)顯示器上顯示圖像。在這個(gè)光路中，只有在焦平面的光才能穿過(guò)探測(cè)針孔，焦平面以外區(qū)域射來(lái)的光線在探測(cè)小孔平面是離焦的，不能通過(guò)小孔。因此，非觀察點(diǎn)的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔與探測(cè)針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像，即共聚焦。以激光作光源并對(duì)樣品進(jìn)行掃描，在此過(guò)程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。
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