微生物菌種液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑,在液氮超低溫(-196℃)下保藏的方法。其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過渡到低溫,并在降到低溫之前,使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過細(xì)胞膜外滲出來,以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。美國ATCC菌種保藏中心采用該法時(shí),把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度,以每分鐘下降1℃/min的速度從0℃直降到-35℃,然后保藏在-150℃~-196℃液氮冷箱中。如果降溫速度過快,由于細(xì)胞內(nèi)自由水來不及滲出胞外,形成冰晶就會(huì)損傷細(xì)胞。據(jù)研究認(rèn)為降溫的速度控制在(1~10)℃/min,細(xì)胞死亡率低;隨著速度加快,死亡率則相應(yīng)提高。
微生物菌種液氮低溫保藏的保護(hù)劑,一般是選擇甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環(huán)、吐溫80等,但zui常用的是甘油(10%~20%)。不同微生物要選擇不同的保護(hù)劑,再通過試驗(yàn)加以確定保護(hù)劑的濃度,原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。
此法操作簡便、、保藏期一般可達(dá)到15年以上,是目前被*的zui有效的菌種長期保藏技術(shù)之一。除了少數(shù)對(duì)低溫?fù)p傷敏感的微生物外,該法適用于各種微生物菌種的保藏,甚至連藻類、原生動(dòng)物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏。此法的另一大優(yōu)點(diǎn)是可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏,無論是孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可采用該保藏法。其缺點(diǎn)是需購置超低溫液氮設(shè)備,且液氮消耗較多,操作費(fèi)用較高。
要使用微生物菌種時(shí),從液氮罐中取出安瓿瓶,并迅速放到35~40℃溫水中,使之冰凍熔化,以無菌操作打開安瓿瓶,移接到保藏前使用的同一種培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行培養(yǎng)。從液氮罐中取出安瓿瓶時(shí)速度要快,一般不超過1min,以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質(zhì)量。并且取樣時(shí)一定要戴手套以防止意外爆炸和凍傷。
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