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高溫抗原修復(fù)因其機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，對某些存在的問題不可能用設(shè)計對照的方法加以解決。有些抗體在冰凍切片上呈陰性反應(yīng)，但石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好地顯示。對某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)過修復(fù)后，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)，例如p185、Bcl—2、P-gp和nm23；而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)過修復(fù)會出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，例如p53、PCNA、ki-67和細(xì)胞周期素等。因此在使用該方法時一定小心，對結(jié)果的判斷也要客觀地作出分析。
某些商品化抗體因自身抗體質(zhì)量的問題，在石蠟切片上無論用什么方法，抗原怎么修復(fù)都無法顯示陽件結(jié)果；還有些抗體在陽性對照切片上有陽性結(jié)果，或文獻(xiàn)報道應(yīng)該有陽性結(jié)果，或從瑪論上講應(yīng)該會有陽性結(jié)果，但檢測結(jié)果為陰性結(jié)果。這導(dǎo)致操作者或研究者在抗原修復(fù)方式上和抗原修復(fù)介質(zhì)上進(jìn)行多種嘗試，力圖使該抗原出現(xiàn)在某些部位，結(jié)果可能仍然為陰性結(jié)果、或陽性很微弱、或假陽性結(jié)果（定位不準(zhǔn)確，一片淡染陽性結(jié)果）。出現(xiàn)上述現(xiàn)象首先應(yīng)該與廠商，或更換抗體或退貨，否則其結(jié)果是不可靠的，其次應(yīng)從組織的固定和方法的選擇上再認(rèn)真查找原因。
在20世紀(jì)的60年代一80年代，人們在利用生物素—親和素（抗生物）組成的親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)以來，已發(fā)現(xiàn)在正常的哺乳類動物和人體細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)源性生物素，以肝、腎、乳腺和脂肪組織內(nèi)含量較高，但在人體的皮膚、淋巴結(jié)和脾臟冷凍組織中未檢測到內(nèi)源性生物素。1994年Cauli等發(fā)現(xiàn)人體唾液腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞存在內(nèi)源性生物素，1997年Rodriguezso—t。等發(fā)現(xiàn)甲醛固定、石蠟包埋的腎臟和肝臟組織中沒有內(nèi)源性生物染色，但該組織用o．01mol／LpH6．0 CB抗原修復(fù)后出現(xiàn)了內(nèi)源性生物素的干擾，表明熱修復(fù)可使甲醛固定和石蠟包埋所遮蓋（mask）的內(nèi)源性生物素重新暴露。國內(nèi)周小鴿等也已證實在人體幾乎所有的正常組織大量的腫瘤組織和動物組織中存在內(nèi)源性生物素，尤其是上皮性腫瘤zui明顯。
生物素是一種維生素，相對分子質(zhì)量為244．3，來自食物和腸道細(xì)菌合成，在人體內(nèi)主要存在于線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，它是多種羧化酶的輔酶，參與糖異生和脂肪酸合成反應(yīng)。因此，代謝旺盛的富含線粒體的細(xì)胞，如大多數(shù)上皮源性細(xì)胞，有較多的內(nèi)源性生物素顯現(xiàn)。由于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞含有豐富的線粒體，因此，腫瘤細(xì)胞易出現(xiàn)內(nèi)源性生物素陽性反應(yīng)（假陽性）。這些假陽性反應(yīng)極易被當(dāng)作特異性反應(yīng)看待，從而出現(xiàn)誤判。如果見到胞質(zhì)中有陽性的棕色顆粒，應(yīng)考慮到內(nèi)源性生物素的干擾，并應(yīng)進(jìn)一步確證。
消除內(nèi)源性生物素的zui有效、zui簡單的辦法就是不用ABC、S-P（LsAB）法，改用En—Vision等方法。另一種辦法就是在熱修復(fù)后，一抗前或一抗后用20％蛋清（20ml蛋清+gOml蒸餾水）于37℃封閉30min，效果非常理想。
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