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原代細(xì)胞核膜的分離

來(lái)源:上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司   2011年01月24日 09:48  

                                                   原代細(xì)胞核膜的分離

試劑和器材www.runwelltac.com: 
1. DNA酶Ⅰ;
2. KCl(1mol/L溶于20mmol/L Tris-HCl,pH7.4);
3. MgCl2(1mol/L儲(chǔ)存液);
4. 苯甲基磺酰氟(PMSF)(無(wú)水乙醇配制的1mol/L儲(chǔ)存液);
5. 純化的細(xì)胞核;
6. 緩沖液:2mmol/L Tris-HCl,pH7.4;
7. 膜懸浮緩沖液(ESB):0.25mol/L蔗糖、2mmol/L Tris-HCl,pH7.4;
8. 梯度溶液:1.0mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2.0mol/L的蔗糖溶于2mmol/L Tris-HCl,pH7.4;
9. 除了MgCl2外的所有溶液須含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟;
10. Abbé折光計(jì);
11. 高速離心機(jī),配有固定角轉(zhuǎn)子和離心管;
12. 超速離心機(jī),配有固定角和吊桶式轉(zhuǎn)子、離心管;
13. 相差顯微鏡;
14. 紫外分光光度計(jì)(配石英比色皿);

實(shí)驗(yàn)方法:
   除特殊注明外,所有操作均在0—4℃下進(jìn)行。
1. 將純化的原代細(xì)胞細(xì)胞核浸于緩沖液中孵育10min使之膨大去凝縮。之后約10000g離心10min,用緩沖液重懸沉淀,并重復(fù)這一步驟2次;
2. 用含DNA酶Ⅰ(0.01g/L)的緩沖液重懸凝膠樣溶脹的細(xì)胞核沉淀。充分混勻并室溫孵育30min,孵育的中途將上清調(diào)節(jié)至含約0.1mmol/L MgCl2。隨著DNA被切割裂解,染色質(zhì)很快失去了凝膠狀特性。可通過(guò)相差顯微鏡檢測(cè)核膜“影子”的產(chǎn)生;
3. 采用固定角轉(zhuǎn)子或吊桶式轉(zhuǎn)子,約60000g離心30min;
4. 用緩沖液重懸核膜粗產(chǎn)物,并再次離心。重復(fù)這一步直至DNA釋放為止(即監(jiān)測(cè)上清在280nm下的吸光度,直至達(dá)到一很低平臺(tái));
5. 選擇性地用KCl溶液洗滌獲得地核膜,以加速離子結(jié)合蛋白,尤其是組蛋白的去除。然后約60000g離心30min;
6. 將核膜用核膜懸浮緩沖液重懸,覆蓋配制的4個(gè)梯度溶液,置于吊桶式離心機(jī)中離心若干小時(shí)或過(guò)夜,以收集核膜等密度層;
7. 純化的核膜應(yīng)該主要聚集在1.5mol/L與1.8mol/L兩蔗糖層的界面,用巴斯德吸管小心地從梯度液中移出核膜層;
8. 通過(guò)相差顯微鏡,或者通過(guò)瓊脂糖包埋進(jìn)行負(fù)染和/或薄片電鏡,檢查核膜的完整性;
9. 對(duì)純化標(biāo)本進(jìn)行必須的生化分析,如SDS-PAGE或是酶學(xué)實(shí)驗(yàn);內(nèi)源性過(guò)氧化物酶是大鼠肝臟核膜的一個(gè)合適的標(biāo)志,同時(shí)也存在Mg-ATP酶以及很多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶;www.runwelltac.com


 

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