應(yīng)用PCR遺傳工程實(shí)驗(yàn)方法

1. 設(shè)計(jì)與合成預(yù)期的末端修改的寡核苷酸引物。

例如，根據(jù) cDNA 模板設(shè)計(jì)的 5'引物為 5' dATCATATGGCTCTG GATGAACT- GTGCCTGCTGGACATGCT3'，3' 引物為 5' dATAAGCTTTTATTAAGACA-GACTCAGCTCATGGGAGGCAA3'，這樣在 cDNA 的 5' 末端引入了 Nde  I (CATATG) 位點(diǎn)，改變了 cDNA 的部分密碼子為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子。下面劃線(xiàn)的核苷酸表示寡核苷酸引物與 cDNA 模板之間是不同的。對(duì)于寡核苷酸引物 3' 末端*配對(duì)的堿基對(duì)數(shù)目究竟是要求多少對(duì)才能成功擴(kuò)增靶基因尚無(wú)定論；然而，具體工作中發(fā)現(xiàn)一般有 8~10 對(duì)*配對(duì)的堿基對(duì)就足夠了。

2. 按以下次序，將各成分加入在 0.5 ml 滅菌離心管，擴(kuò)增管或滅菌滴定板的孔內(nèi)，混合：

100 ng 模板 DNA                   10 μl

10X 擴(kuò)增緩沖液                      5 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液   5 μl

10 μmol/L 引物 1 ( 50 pmol )    5 μl

10 μmol/L 引物 2 ( 50 pmol )    5 μl

1~2 單位熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶    1 μl

H2O 補(bǔ)足至                            50 μl

設(shè)置二支對(duì)照反應(yīng)管，加入以上除了模板 DNA 的所有試劑。在其他反應(yīng)中，加 入包含模板 DNA 的所有以上試劑。通過(guò) PCR 預(yù)期會(huì)產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。試驗(yàn)管與對(duì)照管一同進(jìn)行所有后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟。

3. 如果 PCR 儀沒(méi)有配制加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層應(yīng)加一滴礦物油（約 50 μl)，防止樣品在 PCR 反應(yīng)多個(gè)加熱與冷卻的循環(huán)過(guò)程中蒸發(fā)。如果應(yīng)用熱啟動(dòng) PCR 程序，在反應(yīng)混合液的上層加一層石蠟油。放置離心管和微量滴定板在 PCR 儀上。

4. 按以下方法進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。典型的程序有變性、復(fù)性和聚合（延伸反應(yīng)）；相應(yīng)的循環(huán)條件與溫度列表如下：

5. 抽取每種擴(kuò)增樣品 5%~10%, 用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)分析擴(kuò)增結(jié)果，用 DNA marker 來(lái)判斷擴(kuò)增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來(lái)觀察擴(kuò)增的量與片段大小。

—次成功的擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)該產(chǎn)生與我們預(yù)期大小一致的 DNA 片段。擴(kuò)增條帶可用 DNA 序列分析，SoutKem 雜交和限制性?xún)?nèi)切核酸酶酶切圖譜予以鑒定。

6. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內(nèi)樣品液體的上層（步驟 3)，反應(yīng)結(jié)束后可用 150 μl 抽提去除。

7. 為了后續(xù)的克隆，對(duì) DNA 擴(kuò)增片段應(yīng)用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切核酸酶進(jìn)行消化（酶切位點(diǎn)由引物的 5' 末端導(dǎo)入，上述例子應(yīng)用 NdeⅠ和 HindⅢ）。應(yīng)用凝膠電泳或超濾方法純化酶解片段。

8. 用預(yù)期的載體 DNA 建立適當(dāng)?shù)倪B接反應(yīng)，連接反應(yīng)中插入片段與載體的摩爾比率為 3:1。

應(yīng)用PCR遺傳工程實(shí)驗(yàn)方法