ATCC細(xì)胞培養(yǎng)及外源基因?qū)氲膶?shí)驗(yàn)步驟
ATCC細(xì)胞的傳代培養(yǎng)(*天)
1) 顯微鏡觀察母細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),確定傳代比例。
為了獲得較高的轉(zhuǎn)染效率,必需保證細(xì)胞處于合適的生長(zhǎng)密度,因此應(yīng)根據(jù)母細(xì)胞的生長(zhǎng)密度調(diào)整傳代比例。磷酸鈣轉(zhuǎn)染的合適細(xì)胞密度為50%-70%,本實(shí)驗(yàn)中使用的293細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后一般按照1:6傳代即可。
2) 在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿蓋,倒去皿中的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液,加入2mlHank’s液,輕輕搖動(dòng),將溶液倒出。
3) 消化與分裝。
在培養(yǎng)皿中加入1ml消化液(0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液),37°C靜置5分鐘左右,顯微鏡觀察,如果細(xì)胞變圓且彼此分離表明消化*,此時(shí)可加入10ml營(yíng)養(yǎng)液終止消化,吹打數(shù)次,使培養(yǎng)皿壁上的細(xì)胞全部脫落下來,并分散形成均勻的細(xì)胞懸液。按照傳代的比例補(bǔ)加適當(dāng)體積的營(yíng)養(yǎng)液,吹打混勻后分裝到新的培養(yǎng)皿中。
在分裝好的細(xì)胞培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記,置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2. 用磷酸鈣介導(dǎo)的外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在293細(xì)胞中過量表達(dá)TNF-R1(第二天)
1) 顯微鏡觀察待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)
a. 觀察細(xì)胞是否污染
b. 觀察培養(yǎng)液顏色的變化
c. 觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度
2) 轉(zhuǎn)染
a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg(1μg /μl, 10μl)質(zhì)粒DNA(實(shí)驗(yàn)組為TNF-R1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體,對(duì)照組為空載體),350μl超純水,40μlCaCl2(2.5M)溶液,混勻。
b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS,將A液分三次緩慢加入,每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。
c. 將A,B混合液均勻地滴加在待轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞培養(yǎng)液中,輕輕晃動(dòng)使混勻。將培養(yǎng)皿置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中。
3. ATCC細(xì)胞的形態(tài)觀察,“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析(第三天)
1) 顯微鏡觀察過量表達(dá)TNF-R1(實(shí)驗(yàn)組)和空載體(對(duì)照組)的293細(xì)胞形態(tài)上的差異。
2) 用10ml玻璃吸管將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)皿中的細(xì)胞輕輕吹打下來,收集到15ml離心管中,2000rpm離心5分鐘,沉淀用1mlPBS重懸,轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中,2000rpm離心3分鐘,去除上清液,加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K),重懸細(xì)胞,再加入200μlPBS(2%NP40),顛倒混勻,4°C作用30分鐘,期間顛倒數(shù)次。12,000rpm離心2分鐘,吸出上清,加入1ml乙醇,顛倒混勻,-20°C靜置10分鐘,12,000rpm離心10分鐘,沉淀溶于50μl水中,加入RNaseA(10mg/ml),37°C靜置20分鐘。
3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液,取出50μl進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像儀拍照。
100mg 130409-201011 阿莫西林 含量測(cè)定
100mg 130410-200706 氨芐西林 含量測(cè)定
100mg 130411-200307 新霉胺 雜質(zhì)檢查
50mg 130412-200902 頭孢哌酮S異構(gòu)體 系統(tǒng)適應(yīng)性
100mg 130413-200303 醌式利福平 檢查
50mg 130414-8702 3-甲基利福霉素SV 檢查
50mg 130415-200904 α-苯甘氨酸 雜質(zhì)檢查
50mg 130416-201006 7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸 雜質(zhì)檢查
100mg 130417-8701 無味氯霉素A晶型 檢查
ATCC細(xì)胞
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