植物氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

 植物氧化應(yīng)激活性氧超氧陰離子比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)硝基藍(lán)四氮唑染料，受到超氧陰離子O₂^-的還原，產(chǎn)生不溶性藍(lán)黑*素沉淀，由分光光度儀比色分析，定量檢測(cè)樣品超氧陰離子活性氧族的生成和增加的的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等）等的超氧陰離子檢測(cè)?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O^2-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H₂O₂）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。染料四氮唑蘭（tetrazolium）化合物，包括硝基藍(lán)四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍(lán)（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），一旦受到超氧陰離子O₂^-的直接還原，便產(chǎn)生不溶性藍(lán)黑色甲暨色素，在分光光度儀下（540nm波長(zhǎng)），呈現(xiàn)吸光峰值的變化。據(jù)此定量檢測(cè)植物組織細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子活性氧族的濃度。  

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 120毫升

 裂解液（Reagent B）  20毫升

 緩沖液（Reagent C）  20毫升

 反應(yīng)液（Reagent D）     2毫升

 陰性液（Reagent E）     1毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 反應(yīng)液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解植物組織

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的1毫升 裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)?，重?fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)540nm，并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化； 反應(yīng)液（Reagent D）避免光照
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測(cè)定

• 移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 陰性液（Reagent E）
• 加入100微升 反應(yīng)液（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照

• 樣品測(cè)定

• 移取800微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升待測(cè)樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 加入100微升 反應(yīng)液（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)

五、計(jì)算樣品濃度

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1 （體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.1（樣品容量；毫升）X 7.2（毫摩爾吸光系數(shù)）]＝微摩爾O^2-/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾O^2-/毫克

• 酶標(biāo)板測(cè)定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取200微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板的所有孔中
• 分別加入25微升 陰性液（Reagent E）或待測(cè)樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 分別加入25微升 反應(yīng)液（Reagent D）到96孔板的所有孔中
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 在37℃溫度下孵育60分鐘
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 濃度計(jì)算：

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25 （體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.025（樣品容量；毫升）X 7.2（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）]＝微摩爾O^2-/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾O^2-/毫克

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（比色皿）或80次（酶標(biāo)板）操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 孵育時(shí)，避免光照
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 建議使用比色皿測(cè)定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 測(cè)定值由低到高變化
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 如果超氧陰離子活性氧濃度過(guò)低，可以延長(zhǎng)孵育時(shí)間至4小時(shí)
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本濃度過(guò)低或過(guò)高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 本公司提供系列活性氧檢測(cè)試劑產(chǎn)品 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感