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miRNA靶基因預測與驗證相關問題解答

來源:上海希言科學儀器有限公司   2018年01月05日 11:34  

miRNA主要通過與靶mRNA的結(jié)合,或促使mRNA降解,或阻礙其翻譯,從而抑制目的基因的表達。用生物信息學方法準確快速地預測miRNA的靶基因,可以為研究miRNA功能提供線索。 

下面總結(jié)一些熒光素酶實驗中常見的問題。  

 

1轉(zhuǎn)染成功如何判斷? 
 

共轉(zhuǎn)染的幾個質(zhì)粒中,3' UTR質(zhì)粒及Renilla質(zhì)??赏ㄟ^zui終的luc讀值判斷是否轉(zhuǎn)染成功,而miRNA質(zhì)?;騧imic的轉(zhuǎn)染情況無法從zui終的luc讀值做出判斷,因而針對miRNA,轉(zhuǎn)染是否成功可用以下方法進行: 
i.如轉(zhuǎn)入的miRNA帶熒光標記如GFP,則可直接在轉(zhuǎn)染后、細胞裂解前,顯微鏡下觀察細胞熒光; 
ii.如轉(zhuǎn)入的miRNA不帶任何熒光標記,可考慮進行miRNA的qRT-PCR檢測,通過檢測結(jié)果判斷實驗組2、4、6是否相對其對照組miRNA有顯著過表達。 
iii.設置一個熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參照組,同批轉(zhuǎn)染一個組的細胞,間接反映出同批次實驗的轉(zhuǎn)染情況。  

 

2如何判斷實驗體系無異常,獲得客觀的實驗結(jié)果? 可以從以下幾個方面來考察實驗結(jié)果的客觀性: 

對照的2個實驗組,即實驗組1與實驗組2 luc表達情況應無顯著差異; 轉(zhuǎn)染正常,質(zhì)?;騧imic確保成功轉(zhuǎn)染入細胞; luc檢測值在儀器檢測線性范圍內(nèi)。  
 

3 陰性結(jié)果如何理解? 

在確保實驗體系無異常的前提下,如果zui終檢測到的結(jié)果是陰性結(jié)果,則基本可以判斷目的miRNA不能直接調(diào)控靶基因的表達,不死心的話就再做一次,如果仍然是陰性結(jié)果,死心吧。 
有的同學說我一次做出陽性結(jié)果一次做出陰性結(jié)果咋辦?那就恭喜你再重復吧,結(jié)果一直波動的話可能是實驗系統(tǒng)或其他原因,  

 

4為何與文獻報導有差異? 

實驗中,我們往往會遇到無法重復出文獻中結(jié)果的問題,這是肯定的,不同實驗室實驗條件、實驗材料、實驗細節(jié)并不能確保與文獻*一致所致。因此,只要我們相信自己就行。  
 

5實驗體系是否可以優(yōu)化?如何優(yōu)化?

該實驗的關鍵點在細胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化可通過調(diào)整共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的比例或調(diào)整轉(zhuǎn)染體系來進行,設置合理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量梯度,觀察microRNA對靶基因的抑制是否存在劑量效應或是否存在變化趨勢的一致性,從而使結(jié)論更加可靠。  
 

6使用mimics的一些問題? 

有的同學喜歡使用mimics來做實驗,其實mimics就是體外合成的成熟體miRNA,同樣可以反轉(zhuǎn)錄,用qRT-PCR來檢測表達量,但是大家應該很少看到有文章把mimics的過表達量PCR結(jié)果放出來的吧,那是因為mimics的過表達通常在數(shù)萬到數(shù)十萬倍,miIRNA通常會靶向結(jié)合許多靶基因,這么強的外源過表達肯定會引起嚴重的脫靶效應,給審稿人把柄質(zhì)疑你嗎?對于這種找抽的行為大家肯定是積極規(guī)避的。質(zhì)粒介導的miRNA過表達由于是模擬了前體在生物體內(nèi)的剪切,其過表達通常在數(shù)十倍到數(shù)百倍,可能引起的脫靶效應遠沒有mimics嚴重。 
 
7是否還有其他方法驗證miRNA對靶基因表達的調(diào)控? 

驗證miRNA對靶基因的調(diào)控,也可直接檢測miRNA過表達或下調(diào)表達后,靶基因在mRNA(qRT-PCR方法)或蛋白水平上的變化(Western Blot方法)。

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