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| 問(wèn)題一：高背景 | |
| 可能的原因 | 解決方法 |
| 去污劑不溶性蛋白有殘留 | 離心后立即去除上清，沉淀中留有不溶性蛋白質(zhì)，如果再次有懸浮發(fā)生，再次離心 |
| 洗滌不充分 | 蓋上管蓋離心前反復(fù)顛倒幾次 |
| 非特異性蛋白質(zhì)與珠子結(jié)合 | 珠子用BSA預(yù)封閉不充分，確保牛血清白蛋白（組分V）新鮮，新鮮珠子與含1%牛血清白蛋白的PBS孵育1小時(shí)，使用前PBS洗3-4次 |
| 使用的抗體特異性不強(qiáng) | 使用親和純化的抗體，預(yù)先吸收 |
| 使用太多抗體導(dǎo)致非特異性結(jié)合 | 檢查推薦抗體用量。嘗試使用更少的抗體 |
| 細(xì)胞裂解液中含有太多的細(xì)胞或太多蛋白，導(dǎo)致洗脫液中很多額外的（假陽(yáng)性）蛋白質(zhì) | 減少細(xì)胞數(shù)量/裂解液使用。我們推薦使用10-500ug細(xì)胞裂解液 |
| 蛋白與抗體非特異性結(jié)合 | 如果有很多非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，可以嘗試較少上樣珠子的樣本數(shù)量。您還可以在開(kāi)始免疫沉淀實(shí)驗(yàn)之前預(yù)先孵育珠子和準(zhǔn)備好的裂解液來(lái)預(yù)清除裂解液。應(yīng)該清除裂解液內(nèi)任何與珠子非特異性結(jié)合的蛋白，一些研究人員也使用同種來(lái)源和相同免疫球蛋白亞類(lèi)的無(wú)關(guān)抗體來(lái)預(yù)清除裂解液 |
| 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)時(shí)抗原降解 | 確保樣品裂解時(shí)加入新鮮的蛋白酶抑制劑 |
| 問(wèn)題二：大量抗體被洗脫 | |
| 可能的原因 | 解決方法 |
| 太多抗體與目的蛋白被洗脫 | 嘗試減少抗體用量。免疫沉淀前將抗體與珠子交聯(lián)，并使用溫和的甘氨酸緩沖液梯度洗脫將大大減少抗體洗脫量 |
| 問(wèn)題三：沒(méi)有檢測(cè)到目的蛋白洗脫 | |
| 可能的原因 | 解決方法 |
| 所用樣品中不表達(dá)或低水平表達(dá)目標(biāo)蛋白 | 檢查目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)譜，以確保他會(huì)在您樣品的細(xì)胞表達(dá)。如果有目標(biāo)蛋白低水平表達(dá)，增加裂解液的使用量。但是，這可能導(dǎo)致增加非特異性結(jié)合，所以開(kāi)始免疫沉淀程序之前預(yù)先清除裂解液 |
| 沒(méi)有足夠的抗體捕獲目標(biāo)蛋白 | 檢查抗體的建議使用量?？贵w濃度可能需要增加 |
| 目標(biāo)蛋白沒(méi)有從珠子上洗脫 | 確保您使用的洗脫緩沖液是正確的，并且是洗脫蛋白質(zhì)所需的正確強(qiáng)度和pH值 |
| 抗體沒(méi)有結(jié)合免疫吸附磁珠 | 確保您使用的珠子與抗體亞型匹配 |
| 使用的裂解液不正確 | 檢查說(shuō)明書(shū)，看看抗體是否能檢測(cè)變性蛋白質(zhì)或天然蛋白質(zhì)，并確保使用正確的裂解液 |
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