ELISA trouble shooting

來源：愛必信（上海）生物科技有限公司 2018年03月28日 16:35

問題一:陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果
可能的原因	解決的方法
試劑/樣品污染	試劑和樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑，小心操作移液器
夾心ELISA-檢測抗體與包被抗體反應(yīng)	確定使用的是正確的包被抗體和檢測抗體，他們之間不會相互反應(yīng)
酶標(biāo)板洗板不*	用洗液充滿板空確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈
抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合	根據(jù)推薦用量使用抗體盡量使用較少的抗體

問題二：酶標(biāo)板整體背景高
可能的原因	解決的方法
結(jié)合反應(yīng)太強(qiáng)或時間過長	檢查底物的稀釋，使用建議的稀釋度。當(dāng)酶標(biāo)儀顯色足夠進(jìn)行吸光度讀取是立即用終止液終止反應(yīng)
底物溶液或終止液不是新鮮配制的	使用新鮮配制的底物溶液。終止液應(yīng)該是清亮的（如果它變黃，這是被污染的標(biāo)志，需要重新配制）
沒有終止反應(yīng)	如果底物反應(yīng)沒有被終止，顏色會繼續(xù)變化
酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀度板前放置時間過長	顏色會繼續(xù)變化（盡管加了終止液，依然會以很慢的速度變化）
實(shí)驗(yàn)器皿污染	確保試劑是新鮮配制的并且使用的是清潔的玻璃器皿
底物孵育過程沒有曝光	底物孵育應(yīng)該在避光條件下進(jìn)行
孵育溫度過高	抗體在適宜的溫度下有*的結(jié)合活性。確保孵育在正確的溫度下進(jìn)行，孵育箱要設(shè)定好溫度并正常工作，孵育溫度可能需要一些優(yōu)化
抗體非特異性結(jié)合	確保進(jìn)行了封閉并使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液。我們建議使用5-10%的與二抗同種動物來源的血清或牛血清。確?？装暹M(jìn)過預(yù)處理以防止非特異性結(jié)合。使用親和力強(qiáng)、純度高的抗體，經(jīng)過了預(yù)吸收

問題三：吸光度數(shù)值低
可能的原因	解決的方法
使用的樣品中沒有顯示靶蛋白或者靶蛋白顯示的水平低	檢查靶蛋白表達(dá)系統(tǒng)，確保它在您的樣品中被表達(dá)出來。如果靶蛋白的表達(dá)水平低，需要增加樣品使用量，或者您可能需要選擇一個更加靈敏的檢測方法。確保您使用的是沒有超過測定方法檢測范圍的陽性對照
抗體不足	確定使用的是建議的抗體量，為了使結(jié)果更好可能需要增加抗體的濃度
底物溶液不是新鮮配制或成分有誤	使用新鮮配制底物溶液。確保儲備液在有效期內(nèi)并且正確保存，使用的濃度也是正確的，確保試劑按正確的濃度使用
試劑不是新鮮配制或pH值有誤	確保試劑配制正確并在有效期內(nèi)
孵育時間不夠長	如果建議了孵育時間，確保按推薦的時間長度孵育抗體。為了使結(jié)果更理想，孵育時間可能需要增加
孵育溫度太低	抗體在適宜的溫度下有*的結(jié)合活性，確保孵育時在正確的溫度下進(jìn)行，孵育箱要設(shè)定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優(yōu)化。確保所有的試劑在使用前是室溫
未加終止液	加入終止液可以增加顯色反應(yīng)的強(qiáng)度，也能固定反應(yīng)zui終的顏色

問題四：吸光值高
可能的原因	解決的方法
樣品和/或陽性對照吸光度數(shù)高。吸光度沒有按樣品在板上的稀釋梯度遞減	樣品或陽性對照的濃度過高，超出了實(shí)驗(yàn)方法檢測的范圍。重新設(shè)置實(shí)驗(yàn)方法或者在加樣前稀釋降低樣品和對照的濃度，在處理結(jié)果計(jì)算濃度時考慮到所作的稀釋

問題五：酶標(biāo)板上吸光度不規(guī)律
可能的原因	解決的方法
孵育時酶標(biāo)板疊在一起	酶標(biāo)板疊在一起使板子每個孔的溫度不能平衡一致，請避免堆積
吸液不一致	確保移液器使用正確并進(jìn)過校準(zhǔn)、確保槍頭差的足夠緊密。板子稀釋時要特別仔細(xì)，注意確保每個槍頭都吸上和排除正確量的液體，這對平行樣品結(jié)果的一致性有很大影響
抗體稀釋液/試劑	為保證板子所有孔的濃度一致，確保所有的試劑和樣品在加到板子上以前都被均勻混合
孔板變干涸	確保所有孵育期間酶標(biāo)板始終被蓋好。放置一個潮濕的水盤（確保清潔，無菌水）在孵育箱底部
洗板不充分	這將導(dǎo)致一些孔沒有其他孔清潔的好，殘留不同量的未結(jié)合的抗體，使后面的結(jié)果產(chǎn)生不一致
酶標(biāo)板底部不凈影響吸光度讀取	讀板前小心清潔酶標(biāo)板底部

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