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ELISA trouble shooting

來(lái)源:愛必信(上海)生物科技有限公司   2018年03月28日 16:35  
 
問(wèn)題一:陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果
可能的原因 解決的方法
試劑/樣品污染 試劑和樣品可能被污染,或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑,小心操作移液器
夾心ELISA-檢測(cè)抗體與包被抗體反應(yīng) 確定使用的是正確的包被抗體和檢測(cè)抗體,他們之間不會(huì)相互反應(yīng)
酶標(biāo)板洗板不* 用洗液充滿板空確保每孔被充分洗滌,洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈
抗體量過(guò)多導(dǎo)致非特異性結(jié)合 根據(jù)推薦用量使用抗體盡量使用較少的抗體

 

問(wèn)題二:酶標(biāo)板整體背景高
可能的原因 解決的方法
結(jié)合反應(yīng)太強(qiáng)或時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 檢查底物的稀釋,使用建議的稀釋度。當(dāng)酶標(biāo)儀顯色足夠進(jìn)行吸光度讀取是立即用終止液終止反應(yīng)
底物溶液或終止液不是新鮮配制的 使用新鮮配制的底物溶液。終止液應(yīng)該是清亮的(如果它變黃,這是被污染的標(biāo)志,需要重新配制)
沒(méi)有終止反應(yīng) 如果底物反應(yīng)沒(méi)有被終止,顏色會(huì)繼續(xù)變化
酶標(biāo)板在酶標(biāo)儀度板前放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 顏色會(huì)繼續(xù)變化(盡管加了終止液,依然會(huì)以很慢的速度變化)
實(shí)驗(yàn)器皿污染 確保試劑是新鮮配制的并且使用的是清潔的玻璃器皿
底物孵育過(guò)程沒(méi)有曝光 底物孵育應(yīng)該在避光條件下進(jìn)行
孵育溫度過(guò)高 抗體在適宜的溫度下有*的結(jié)合活性。確保孵育在正確的溫度下進(jìn)行,孵育箱要設(shè)定好溫度并正常工作,孵育溫度可能需要一些優(yōu)化
抗體非特異性結(jié)合 確保進(jìn)行了封閉并使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液。我們建議使用5-10%的與二抗同種動(dòng)物來(lái)源的血清或牛血清。確??装暹M(jìn)過(guò)預(yù)處理以防止非特異性結(jié)合。使用親和力強(qiáng)、純度高的抗體,經(jīng)過(guò)了預(yù)吸收

 

問(wèn)題三:吸光度數(shù)值低
可能的原因 解決的方法
使用的樣品中沒(méi)有顯示靶蛋白或者靶蛋白顯示的水平低 檢查靶蛋白表達(dá)系統(tǒng),確保它在您的樣品中被表達(dá)出來(lái)。如果靶蛋白的表達(dá)水平低,需要增加樣品使用量,或者您可能需要選擇一個(gè)更加靈敏的檢測(cè)方法。確保您使用的是沒(méi)有超過(guò)測(cè)定方法檢測(cè)范圍的陽(yáng)性對(duì)照
抗體不足 確定使用的是建議的抗體量,為了使結(jié)果更好可能需要增加抗體的濃度
底物溶液不是新鮮配制或成分有誤 使用新鮮配制底物溶液。確保儲(chǔ)備液在有效期內(nèi)并且正確保存,使用的濃度也是正確的,確保試劑按正確的濃度使用
試劑不是新鮮配制或pH值有誤 確保試劑配制正確并在有效期內(nèi)
孵育時(shí)間不夠長(zhǎng) 如果建議了孵育時(shí)間,確保按推薦的時(shí)間長(zhǎng)度孵育抗體。為了使結(jié)果更理想,孵育時(shí)間可能需要增加
孵育溫度太低 抗體在適宜的溫度下有*的結(jié)合活性,確保孵育時(shí)在正確的溫度下進(jìn)行,孵育箱要設(shè)定好適宜的溫度并正常工作。孵育溫度可能需要一些優(yōu)化。確保所有的試劑在使用前是室溫
未加終止液 加入終止液可以增加顯色反應(yīng)的強(qiáng)度,也能固定反應(yīng)zui終的顏色

 

問(wèn)題四:吸光值高
可能的原因 解決的方法
樣品和/或陽(yáng)性對(duì)照吸光度數(shù)高。吸光度沒(méi)有按樣品在板上的稀釋梯度遞減 樣品或陽(yáng)性對(duì)照的濃度過(guò)高,超出了實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)的范圍。重新設(shè)置實(shí)驗(yàn)方法或者在加樣前稀釋降低樣品和對(duì)照的濃度,在處理結(jié)果計(jì)算濃度時(shí)考慮到所作的稀釋

 

問(wèn)題五:酶標(biāo)板上吸光度不規(guī)律
可能的原因 解決的方法
孵育時(shí)酶標(biāo)板疊在一起 酶標(biāo)板疊在一起使板子每個(gè)孔的溫度不能平衡一致,請(qǐng)避免堆積
吸液不一致 確保移液器使用正確并進(jìn)過(guò)校準(zhǔn)、確保槍頭差的足夠緊密。板子稀釋時(shí)要特別仔細(xì),注意確保每個(gè)槍頭都吸上和排除正確量的液體,這對(duì)平行樣品結(jié)果的一致性有很大影響
抗體稀釋液/試劑 為保證板子所有孔的濃度一致,確保所有的試劑和樣品在加到板子上以前都被均勻混合
孔板變干涸 確保所有孵育期間酶標(biāo)板始終被蓋好。放置一個(gè)潮濕的水盤(確保清潔,無(wú)菌水)在孵育箱底部
洗板不充分 這將導(dǎo)致一些孔沒(méi)有其他孔清潔的好,殘留不同量的未結(jié)合的抗體,使后面的結(jié)果產(chǎn)生不一致
酶標(biāo)板底部不凈影響吸光度讀取 讀板前小心清潔酶標(biāo)板底部

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