針對樣品的常見問題：

Q：細(xì)胞水平要做Western Blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠Western Blot？

A：一般地5* 10⁶就足夠了。

Q: 同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白嗎，這樣對Western Blot有無影響? 

A：能，沒有問題的。

Q: 同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎？

A：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測幾十種樣品。

Q: 如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？

A: 如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時(shí)建議加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

Q: 蛋白變性后可以存放多久？

A：－80℃，一兩年沒有問題。zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。

Q: 如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。

A：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm厚度的凝膠。

Q: 接下來我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù)，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？ 

A：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用BSA代替應(yīng)該好一點(diǎn)，此外如果用于磷酸化指標(biāo)蛋白的檢測時(shí)也不能用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻欣业鞍住?/span>

Q：一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？

A：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長短有關(guān)。開始摸條件時(shí)，為了拿到陽性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。

Q: 做組織樣品的western的時(shí)候，處理樣品有什么訣竅嗎？還有，您用過大牛血清做封閉劑嗎？濃度如何？效果是不是比BSA好一點(diǎn)？

A：組織樣品必須進(jìn)行研磨、勻漿超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制劑 cocktail），封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗體，使用BSA也是不錯(cuò)的選擇。

Q: 大分子量蛋白200 kD，在做western要注意什么呢？

A：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠建議選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。

Q：蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？

A：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等， 如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超過0.3μg/mm²。

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