蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用,以增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì),提高雜交信號(hào).但蛋白酶K的濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高時(shí),都會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞,導(dǎo)致組織切片的脫落,細(xì)胞核的消失,從而影響雜交結(jié)果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現(xiàn)的問(wèn)題,并能達(dá)到理想的染色效果。
蛋白酶K的應(yīng)用比較廣泛,它可以消化包圍靶DNA蛋白,因此使用蛋白酶K能夠增加探針 與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì)增強(qiáng)雜交信號(hào),但在使用蛋白酶K時(shí)要主要使用的濃度,過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、核消失等影響試驗(yàn)結(jié)果。
蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶,它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵,此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定,還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力,因而它應(yīng)用很廣泛,包括制備脈沖電泳的染色體DNA,蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶,蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml.在較廣的pH范圍內(nèi)(pH 4-12.5)均有活性。推薦反應(yīng)緩沖液:50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn):20mg/ml蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)(proteinase K):將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中,輕輕搖動(dòng),直至蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml,然后分裝成小份貯存于-20℃.蛋白酶K的保存:保存在-20℃冰箱里,避免反復(fù)凍融,有效保證12月.孵育溫度為55至65℃,理想孵育溫度為58℃,孵育時(shí)間為15分鐘至48小時(shí);理想孵育時(shí)間為2小時(shí).
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