植物a-淀粉酶（a-AMYLASE）活性DNS比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

 植物a-淀粉酶（a-AMYLASE）活性DNS比色法定量檢測試劑是一種旨在使用具有還原力的黃色3,5-二硝基水楊酸與受到a-淀粉酶中性環(huán)境下水解產(chǎn)生的還原基團分子反應(yīng)，生成強烈吸光的3-氨基-5-硝基水楊酸，即采用比色法測定其還原后峰值的升高變化，以此測定樣品中a-淀粉酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種新鮮植物組織，包括葉片（leaf）、谷粒（grain）、種子（seed）等裂解萃取液樣品a-淀粉酶的活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

淀粉酶（AMYLASE）屬于糖苷水解酶類（glycoside hydrolase）。淀粉酶通過水解方式，分解淀粉的α-1,4鏈接，釋放出葡萄糖、麥芽糖（maltose）、麥芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等簡單糖分子。淀粉酶分成三類：α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。其中α淀粉酶（EC 3.2.1.1），又稱為α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）或糖原酶（glycogenase），是鈣離子依賴性鈣金屬蛋白酶（calcium metalloenzyme），分解淀粉為葡萄糖、麥芽糖（maltose）、麥芽三糖（maltotriose）、糊精（dextrin）等，為主要的消化酶，尤其在人體中，例如唾液和胰淀粉酶等。β淀粉酶（EC 3.2.1.2），又稱為α-1,4-葡聚糖麥芽糖水解酶（1,4-α-D-glucan maltohydrolase）或糖基淀粉酶（saccharogen amylase），分解淀粉為葡萄糖等。植物、真菌、細菌等均能產(chǎn)生，而人體組織不含有。γ-淀粉酶（EC 3.2.1.2），又稱為α-1,4-葡聚糖葡萄糖苷酶（Glucan 1,4-α-glucosidase）或溶酶體α-葡萄糖苷酶（lysosomal α-glucosidase），在酸性環(huán)境下分解淀粉為葡萄糖。淀粉是一種復(fù)雜分子，由多聚糖直鏈淀粉（amylose）和支鏈淀粉（amylopectin）構(gòu)成。植物和細菌產(chǎn)生大多數(shù)淀粉。在淀粉酶的催化作用下，分解產(chǎn)生簡單糖分子，作為能源儲存，植物用于光合作用。植物和細菌性淀粉酶常用于工業(yè)，包括烘培食物和乳制品的制造，以及酒精和紙材的生產(chǎn)。基于淀粉，在中性環(huán)境下，通過α-淀粉酶的水解，釋放出麥芽糖等含有游離的還原性基團（例如酮基等），進一步使用具有還原力的黃色3,5-二硝基水楊酸（3,5-Dinitrosalicylic acid；DNS）與之反應(yīng)，產(chǎn)生紅棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸（3-amino-5-nitrosalicylic acid），在分光光度儀（540nm波長）下測定，以定量分析α-淀粉酶的活性。其反應(yīng)方式為：   

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B） 毫升

 緩沖液（Reagent C） 毫升

 反應(yīng)液（Reagent D） 毫升

 底物液A（Reagent E） 毫升

 底物液B（Reagent F） 毫升

 補充液（Reagent G） 毫升

 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）   毫升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存在4℃冰箱里； 底物液B（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.2毫升離心管：用于配制標(biāo)準(zhǔn)樣品的容器

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

尼龍網(wǎng)（nylon mesh）：用于去除殘渣

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品處理

沸水裝置：用于反應(yīng)物孵育

比色皿：用于比色測定的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

一、樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx毫升 裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 置于冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下） 
• 準(zhǔn)備1個小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或150微米的尼龍網(wǎng)（nylon mesh），置于15毫升錐形離心管上
• 將所有組織勻漿物移入到小型漏斗里過濾
• （選擇步驟）或者放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移取無渣液分裝到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作（注意：后續(xù)操作須在2小時內(nèi)完成）

二、測定準(zhǔn)備

• 從-70℃取出待測樣品（例如植物組織裂解懸液樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長為540nm，并置零 
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
• 測定開始前，移出xx微升 底物液B（Reagent F）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升 底物液A（Reagent E），混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為 底物工作液（2次操作），放在暗室里備用。然后進行下列操作

• 標(biāo)準(zhǔn)樣品測定

• 準(zhǔn)備好5個2.2毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管
• 分別加入xx毫升 緩沖液（Reagent C）到1至5號管
• 移取xx毫升 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號管，混勻
• 小心移取xx毫升1號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號管，混勻
• 小心移取xx毫升2號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號管，混勻
• 小心移取xx毫升3號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

• 分別移取xx微升上述配制的系列 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1.5毫升離心管
• 分別加入500微升上述配制的 底物工作液
• 在沸水里孵育5分鐘 ，避免光照
• 在室溫下靜置15分鐘冷卻，避免光照
• 分別移取100微升上述反應(yīng)液到新的比色皿
• 分別加入xx毫升 補充液（Reagent G），混勻
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實驗步驟8至14四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖濃度（毫摩爾/升）

• 樣品和背景測定

• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
• 加入50微升待測樣品（100微克裂解萃取蛋白）或 補充液（Reagent G）
• 25℃溫度下，孵育3分鐘
• 分別加入xx微升 反應(yīng)液（Reagent D），混勻
• 25℃溫度下，孵育3分鐘
• 分別加入xx微升上述配制的 底物工作液
• 在沸水里孵育5分鐘，避免光照
• 在室溫下靜置15分鐘冷卻，避免光照
• 分別移取100微升上述反應(yīng)液到新的比色皿
• 分別加入xx毫升 補充液（Reagent G），混勻
• 即刻放進分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)
• 實際樣品吸光讀數(shù)：樣品吸光讀數(shù)－背景吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)麥芽糖濃度（毫摩爾/升）
• 測算樣品酶活性：

注意事項

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)樣品測定
• 操作時，須戴手套
•  底物工作液注意避光
• 樣品檢測前，須溶解和澄清
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 測定值由低到高變化，表明有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• a-淀粉酶活性單位濃度定義：在25℃室溫下，pH 6.9的情況下，每單位酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）釋放1微摩爾的麥芽糖分子
• 本公司提供系列淀粉酶學(xué)分析技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確