細胞胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS）活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 細胞胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS）活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用胱硫醚-β-合成酶、賴氨酸脫羧酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng)中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光譜法測定其氧化后峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算單位酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種動物和人體細胞裂解懸液等胱硫醚-β-合成酶的活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。

技術背景

胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase；CBS；EC4.2.1.22），又稱為β-硫解酶（β-thiolase）或半胱氨酸合成酶（cysteine synthase），屬于水解酶（hydrolyase）家屬中的一員，作用于硫代謝中轉硫通路（transsulfuration pathway）或胱氨酸（cysteine）代謝的*步。在輔因子磷酸吡哆醛（Pyridoxal Phosphate）和S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine；adoMet）的幫助下，催化將同型胱氨酸（homocysteine）轉化為胱硫醚（cystathionine）的反應。人體胱硫醚-β-合成酶為四體蛋白，551氨基酸。但心臟、肺、睪丸、脾臟不具有胱硫醚-β-合成酶活性。其基因突變引起胱硫醚-β-合成酶缺失，將導致高胱氨酸尿癥（homocystinuria），一種高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia；HHC）；而胱硫醚-β-合成酶異常高度表達，為唐氏綜合癥的特征之一。 基于底物絲氨酸（serine）和半胱氨（cysteamine）， 受到胱硫醚-β-合成酶的水解，進而通過賴氨酸脫羧酶（Lysine decarboxylase；LDC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase；PEPC）和蘋果酸酸脫氫酶（malate dehydrogenase；MDH）反應系統(tǒng)中，由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），所產生的峰值變化（340nm），來定量分析胱硫醚-β-合成酶的活性。其反應系統(tǒng)為：

產品內容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B）      毫升

 緩沖液（Reagent C） 毫升

 酶促液（Reagent D）      微升

 反應液（Reagent E）      微升

 底物液（Reagent F） 微升

 陰性液（Reagent G）   微升

產品說明書    1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融； 底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

細胞刮脫棒：用于細胞脫離

微型臺式離心機：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應孵育

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光譜分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光譜分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化； 底物液（Reagent F）注意避光； 緩沖液（Reagent C）室溫下預熱。然后進行下列操作。

• 樣品準備

• 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準備

• 準備好上述待測樣品，置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長為340nm，間隔2分鐘，讀數6次（共10分鐘），并置零
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升 反應液（Reagent E）
• 加入xx微升 底物液（Reagent F）
• 放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升 陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘

• 樣品活性測定

• 移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升 酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升 反應液（Reagent E）
• 加入xx微升 底物液（Reagent F）
• 放進37℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入10微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數：340波長讀數0分鐘 －340波長讀數10分鐘

• 計算樣品活性

• 酶標儀測定

• 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里
• 分別加入xx微升 酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升 反應液（Reagent E）
• 分別加入xx微升 底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升 陰性液（Reagent G）或待測樣品（100微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和10分鐘讀數
• 活性計算

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 建議樣品忌用碳酸鹽處理
• 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光譜測定
• 反應測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)10分鐘
• 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數高于10分鐘測定讀數，表明有酶活性
• 光譜測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 胱硫醚-β-合成酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 8.0條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列轉硫通路類酶學技術產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經鑒定檢測準確