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無論使用哪種固定方法，抗體結(jié)合及檢測的步驟基本相同。其方法學(xué)及理論與其他組織來源的染色均相似。在鑒定和證實陽性反應(yīng)方面應(yīng)注意交叉反應(yīng)。在前述組織切片染色部分已討論關(guān)于抗體選擇和對抗原正確定位的方法。對于在蟲體中進行抗原免疫定位的一個主要優(yōu)點是可檢測一個無效基因。如果可能的話，它對某些動物染色是非常有用的，這些動物可以攜帶一個突變基因或用RNAi處理過的，以抑制所研究抗原的合成。這樣會提供一個有用的對照，從而證實一種染色模式。顯然，在某些情況下，如基因功能的缺失是致命的，這種對照將是不可能的。
對于蟲體免疫染色來說，zui常用的方法是應(yīng)用熒光染料標記的試劑。在對蟲體的抗原進行研究中常常不使用酶標的二級試劑。其原因主要在于熒光染料對于抗原定位具有高度分辨力。
1．背景問題
影響蟲體染色的一個重要因素是由于特異性和非特異性的交叉反應(yīng)所造成的較高背景。除了在檢測復(fù)雜組織的抗原時所遇到的問題外，蟲體染色尚有一些特殊的問題。
*個問題是通過強烈固定和透化處理方法可破壞許多抗原表位，增加了交叉反應(yīng)發(fā)生的可能性。故需要使用多種抗體，并從中發(fā)現(xiàn)一種于所檢測抗原的抗體。
蟲體免疫染色所涉及的另一問題是多克隆抗體的使用。多克隆抗血清幾乎均含有抗細菌的抗體，這些細菌存在于產(chǎn)生抗體的宿主動物體內(nèi)。通常存在于腸道和皮膚，或在抗感染過程中形成。因為蟲體通常以細菌，如大腸埃希菌為食，這些抗體會混淆染色模式。如有可能，應(yīng)使用單克隆抗體以代替多克隆抗體。如果使用多克隆抗體，可以采用兩種策略：①所需的抗體可以通過抗原親和柱純化；②不是所需的抗體可以通過使用丙酮干燥臟粉預(yù)吸收去除。
2．蟲體的復(fù)染
在應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測蟲體，復(fù)染是必要的。復(fù)染還可用以鑒定抗原在細胞中的確切位置。可采用兩種通常的方法：①使用一種對核酸特異的熒光染料標記所有的細胞，通常DAPI適用于落射式熒光顯微鏡，碘化丙酮（P1）適用于共聚焦顯微鏡。將這些染料加到洗滌緩沖液中即可；②利用受組織特異啟動子驅(qū)使的GFP。將這些基因插入到表達載體中，通過其表達來鑒定細胞。正常情況下使用GFP表達，或者使用GFP抗體（可購買）。
3．對照
特異性染色反應(yīng)需要與對照進行比較。為了準確評價染色模式，應(yīng)對來自同一種屬的兩種抗體進行比較。對于多克隆抗體，的對照是事先從制備特異性抗體的同一動物免疫前采集的血清，但也可以使用來自相同種屬的非免疫動物的血清。對于單克隆抗體而言，對照應(yīng)該與特異性抗體的來源相同；例如，細胞培養(yǎng)上清對比上清，小鼠腹水對比腹水，純化抗體對比純化抗體。對照抗體應(yīng)該與特異性抗體的類和亞類相同。來自親代骨髓瘤的細胞培養(yǎng)上清不適合作為對照，因為其中并不包含抗體。適宜的對照雜交瘤細胞株可從ATCC或歐洲動物細胞培養(yǎng)保藏中心獲得。此外，應(yīng)該檢測二級試劑。在可能的情況下，同時對攜帶所研究抗原基因缺失的蟲體進行染色。這將為特異性抗體提供一個*的遺傳對照。
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