NP-40 裂解液

產(chǎn)品簡介：

    多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白，如 Triton、SDS、NP-40 等。NP-40 裂解液(NP-40 Lysis Buffer)是采用一種溫和的裂解方法獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于 PAGE 電泳、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

    Jisskang NP-40 Lysis Buffer 主要由Tris-HCl、NaCl、NP-40 以及sodium pyropho-sphate，β-glycerophosphate，sodium fluoride, EDTA等多種蛋白酶抑制劑組成。用NP-40 Lysis Buffer得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量試劑盒和Bradford蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

產(chǎn)品組成：

操作步驟(僅供參考)：

(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞

1、取NP-40 Lysis Buffer置于室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為 1mM。

2、去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用 PBS、NS 或無血清培養(yǎng)液清洗1次，低速離心，棄上清，留取沉淀。

3、按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入NP-40 LysisBuffer 。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或4℃裂解15～30min，通常裂解液作用于細(xì)胞1～3s內(nèi)，細(xì)胞就會被裂解。

4、10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

5、進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞

1、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。

2、用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150～200μl含有PMSF的裂解液的比例，加入NP-40 Lysis Buffer 。通常6孔板每孔細(xì)胞加入150μl裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。

3、10000～12000g，4℃離心5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

4、進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(三)組織樣本

1、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。把組織剪切成細(xì)小的碎片，越小越好。

2、取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

3、按照每20mg組織加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30～60min。

4、步驟3、4亦可以采用如下過程：按照每 20mg組織加入150～250μl裂解液的比例，加入含有PMSF的NP-40 Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過程盡量控制在1～2min之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

5、10000～12000g，4℃離心5～15min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

6、進(jìn)行后續(xù)的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項：

1、在貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的操作步驟中，去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。

2、如果裂解丌充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。

3、在培養(yǎng)細(xì)胞的裂解中，如果細(xì)胞量較多，必需分裝成 50～100 萬細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

4、如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈 Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是丌如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

5、溶解 Leagene NP-40 Lysis Buffer 時，應(yīng)盡量縮短溶解時間，避免裂解液中的有效成分失效。

6、細(xì)胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或 4℃進(jìn)行。

7、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期：12個月有效。