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抗體的純化:鹽析法

來(lái)源:上海希言科學(xué)儀器有限公司   2018年07月09日 11:10  

精制抗體的方法很多。一般采用綜合技術(shù),避免蛋白變性。如分離IgG時(shí),多結(jié)合使用鹽析法與離子交換法,以求純化。提取IgM的方法也很多,如應(yīng)用凝膠過(guò)濾與制備電泳法,或離子交換與凝膠過(guò)濾等。

一、原理

蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度,以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液,中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì),于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時(shí),中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后,由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變,蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和,更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低,使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。

1、試劑

(1)正常人混合血清;滅菌生理鹽水。

(2)飽和硫酸銨溶液的配制

稱(NH4)2SO4(AR)400~425克,以50~80℃之蒸餾水500ml溶解,攪拌20分鐘,趁熱過(guò)濾。冷卻后以濃氨水(15N NH4OH)調(diào)PH至7.4。配制好的飽和硫酸銨,瓶底應(yīng)有結(jié)晶析出。

(3)萘氏試劑配制

稱HgI 11.5克,KI8克,加蒸餾水至50ml,攪拌溶解后,再加入20%NaOH 50ml。

(4)0.02M,PH7.4磷酸鹽緩沖鹽液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制:

貯存液

A液:0.2M Na2HPO4:Na2HPO4·12H2O 71.64克,加蒸餾水至1000ml;

B液: 0.2M NaH2P4:NaH2P4·2H2O 3.12克,加蒸餾水至1000ml;

應(yīng)用液:取A液81ml加B液19ml混合,再以生理鹽水作10倍稀釋即成。

(5)0.1M,PH7.4磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer P配制

將上述A液取81ml與B液19ml混合,再以蒸餾水對(duì)倍稀釋即成。

(6)20%磺基水楊酸。

2、器材

普通冰箱、離心機(jī)、電磁攪拌器,751桮型紫外分光光度計(jì)、扭力天平,粗天平。透析袋、尼龍繩、細(xì)竹棒、精密PH試紙(PH5.5~9.0)、眼科鑷子、小剪刀。燒杯、量筒、吸管、滴管、滅菌小瓶、試管等。

3、實(shí)驗(yàn)操作

取1X ml血清加1X ml生理鹽水,于攪拌下逐滴加入2X ml飽和硫酸銨,硫酸銨的終飽和度為50%。

↓4℃,3h以上,使其充分沉淀  

離心(3000rpm),20min,充上清,以x ml生理鹽水溶解沉淀,再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。

↓置4℃3h以上,[此時(shí),(nh4)2so4的飽和度為33%]

重復(fù)上述第二步過(guò)程1~2次。末次離心后所得沉淀物為γ-球蛋白,以0.02% mol/l pH7.4pbs溶解至x ml裝入透析袋。

↓對(duì)PBS充分透析、換液3次,至萘氏試劑測(cè)透析外液無(wú)黃色,即無(wú)NH4+為止。

取透析袋內(nèi)樣品少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后,以752型紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量。

4、影響鹽析的因素

影響鹽析的因素很多,如蛋白質(zhì)的濃度,鹽的濃度,飽和度和pH,溫度等都可影響鹽析的結(jié)果,操作時(shí)要充分注意。

(1)蛋白質(zhì)的濃度

鹽析時(shí),溶液中蛋白質(zhì)的濃度對(duì)沉淀有雙重影響,既可影響蛋白質(zhì)沉淀極限,又可影響蛋白質(zhì)的共沉作用。蛋白質(zhì)濃度愈高,所需鹽的飽和度極限愈低,但雜蛋白的共沉作用也隨之增加,從而影響蛋白質(zhì)的純化。故常將血清以生理鹽水作對(duì)倍稀釋后再鹽析。

(2)離子強(qiáng)度

各種蛋白質(zhì)的沉淀要求不同的離子強(qiáng)度。例如當(dāng)硫酸銨飽和度不同,析出的成分就不同,飽和度為50%時(shí),少量白蛋白及大多數(shù)擬球蛋白析出;飽和度為33%時(shí)γ球蛋白析出。

(3)鹽的性質(zhì)

有效的鹽是多電荷陰離子。

(4)PH值

一般說(shuō)來(lái),蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多,它的溶解度越大。改變PH改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì),也就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。

(5)溫度

鹽析時(shí)溫度要求并不嚴(yán)格,一般可在室溫下操作。血清蛋白于25℃時(shí)較0℃更易析出。但對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì),則應(yīng)于低溫下鹽析。

(6)蛋白質(zhì)沉淀后宜在4℃放3小時(shí)以上或過(guò)夜,以形成較大沉淀而易于分離。

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