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流式細胞儀檢測細胞凋亡:Heochst 33342/PI雙染色法

來源:上海希言科學儀器有限公司   2018年07月25日 11:57  
方法原理經(jīng)固定的凋亡細胞其染色體熒光染料的DNA可染性性下降。細胞一經(jīng)固定就不再是活細胞,而且細胞固定過程對細胞膜的通透性也有影響。因此發(fā)展了用“細胞活性”鑒定染料染色的流式細胞儀檢測方法。這些方法細胞不經(jīng)固定就直接用DNA染料染色,且染料的濃度要比固定細胞所用的濃度要低得多。

流式細胞儀通常根據(jù)細胞膜完整性將細胞分為“活細胞”和“死細胞”,因此正常細胞和凋亡細胞歸為活細胞。活細胞染料如Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高,Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度增高的機制與凋亡細胞膜通透性發(fā)生改變有關(guān),凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯性改變,但細胞膜的通透性已有增強,因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多。

此外,還與凋亡細胞的染色體DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結(jié)合以及凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內(nèi)積累增加等有關(guān)。既然Hoechst 33342進入凋亡細胞中比正常細胞更容易,而EB、PI或7-AAD等染料是不能進入細胞膜完整的活細胞中,即正常細胞和凋亡細胞在不經(jīng)固定的情況下對這些染料是拒染,壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損,可被這些染料染色。

根據(jù)這些特性,用Hoechst 33342結(jié)合PI或EB等染料對凋亡細胞進行雙染色,就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上,這三群細胞表現(xiàn)分別為:正常細胞為低藍色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡細胞為高藍色/低紅色(Hoechst 33342++/PI+),壞死細胞為低藍色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++)。
實驗材料

細胞

試劑、試劑盒

Heochst 33342 染液  PBS  蒸餾水

儀器、耗材

400目篩網(wǎng)  流式細胞儀  冰箱

實驗步驟

一、細胞培養(yǎng)

懸浮生長的細胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入Heochst 33342 ,終濃度為1 ug/ml; 37℃孵育7-10 min。

 

二、細胞收集

低溫500 ~ 1 000 r/min離心5min棄去染液。

 

三、染色

加入1.0 ml PI染液,4℃避光染色15 min。

 

四、過濾

400目的篩網(wǎng)過濾1次。

 

五、流式細胞儀分析

Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外線熒光,激發(fā)光波波長為352 nm,發(fā)射光波波長為400 ~ 500 nm,產(chǎn)生蘭色熒光;PI用氬離子激光激發(fā)熒光,激發(fā)光波波長為488 nm,發(fā)射光波波長大于630 nm,產(chǎn)生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。

 

六、結(jié)果判斷

在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上,結(jié)果為:正常細胞為低藍光/低紅光,凋亡細胞為高藍光/低紅光,壞死細胞為低藍光/高紅光。

收起 
注意事項

1.  在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上,還可見到細胞凋亡區(qū)向細胞壞死區(qū)遷移的軌跡,可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故。

 

2.  用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長,一般控制在20 min之內(nèi)為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光的遷移,導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,從而影響結(jié)果的判斷。

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