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來源:愛必信(上海)生物科技有限公司   2018年08月17日 09:31  

【愛必信實(shí)驗(yàn)小貼士】免疫組織化學(xué)

一、定義:

細(xì)胞化學(xué),是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng),對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)。

二、分類:

根據(jù)染色在整個(gè)制片中的位置分為:包埋前染色、包埋后染色;

根據(jù)標(biāo)記物種類分為:免疫熒光法、免疫過氧化物酶法、免疫鐵蛋白法、免疫膠體金法;

按標(biāo)記物的位置分為:

    直接法:標(biāo)記物結(jié)合在直接與組織抗原發(fā)生免疫結(jié)合的特異性抗體,即抗體上;

    間接法:標(biāo)記物通過其所標(biāo)記的非特異抗體,即第二抗體間接地與抗體結(jié)合;

    標(biāo)記物——抗體復(fù)合法。

三、原理:

免疫組化染色是引入附有標(biāo)記物的外源性抗體(或抗原),使之錨定于組織或細(xì)胞標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(或抗體)部位,標(biāo)記物經(jīng)呈色反應(yīng)而顯示待檢抗原(或抗體)。

四、主要過程:

1、脫蠟水化:

切片在脫蠟前,放在APES(防止脫片用的,缺點(diǎn)是有低毒性) 150 丙酮溶液中浸泡3分鐘,晾干或60°C恒溫箱中烘烤20分鐘,然后將組織切片置于二甲苯中浸泡10min,更換二甲苯再浸泡10min,無水乙醇浸泡 10min,更換無水乙醇再浸泡10min,然后依次95%乙醇,70%乙醇,50%的乙醇各5min,后用蒸餾水浸泡 5min;

2、清洗:先用蒸餾水溫柔的沖洗一會(huì),更換PBS沖洗5min,再用PBS沖洗5min;

3、抗原修復(fù):

1)微波爐加熱:適用于來源于人、大鼠、小鼠的組織標(biāo)本;來源于其他動(dòng)物種屬的組織標(biāo)本;

2)高壓熱修復(fù):適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù);

3)酶消化方法:適用于被固定遮蔽的抗原:包括 Collagen.GFAP. Complement. Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。

4、封閉:用和二抗來源一致的血清在保濕盒中于37℃孵育15-30min,然后甩去封閉用血清;

5、一抗孵育:

滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,將切片放在保濕盒中于4冰箱中過夜孵育或者溫箱37孵育1-2個(gè)小時(shí)。

6、清洗:過夜后的切片用PBS沖洗2,沖洗3次;

7、二抗孵育:

滴加標(biāo)記二抗在保濕盒中于37孵育30分鐘。

8、清洗:切片用PBS沖洗2min,沖洗3次;

9、顯色:加入顯色劑顯色,根據(jù)顯微鏡下的觀察決定終止顯色的時(shí)間一般都在3-10min左右,常用5min。

10、沖洗:充分沖洗10-15min,

11、復(fù)染

12、脫水透明

依次用50% 70%, 95%酒精各5min浸泡切片,后用100%酒精浸泡10min,更換酒精浸泡10min,后用二甲苯浸泡10分鐘,更換二甲苯,再浸泡10min;

13、封片

撈出,用樹脂封片,一滴/,在其上蓋上小玻片封好的組織切片,放入超凈臺(tái)中,打開抽風(fēng),沖一段時(shí)間,后把切片放在窗臺(tái)上涼2-3天。

 

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