通常未知天然物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析都是首先將原料抽提物經(jīng)過多級(jí)的色譜分離，然后運(yùn)用質(zhì)譜和核磁共振光譜（NMR）的方法來進(jìn)行的。此時(shí)為了進(jìn)行核磁共振分析采用了分級(jí)收集器對(duì)色譜峰進(jìn)行截取、與流動(dòng)相分離、在重氫化的溶劑中溶解，后進(jìn)行測(cè)量。特別是在分級(jí)收集之后除去流動(dòng)相的時(shí)候往往出現(xiàn)一些問題：一是在進(jìn)行分離時(shí)所用的緩沖劑和鹽也同時(shí)被富集；二是包含于溶劑中的雜質(zhì)也同時(shí)被濃縮。在種情況下可能導(dǎo)致所提純的化合物分解；第二種情況下則可能使得所尋找的化合物的核磁共振與那些雜質(zhì)的共振難以區(qū)別。因此這種方法僅適用于天然物質(zhì)抽提液的主要和次要組分的分析。

替換方案：固相材料的柱后富集法

所提出的替代方案是：將色譜與高分辨率的NMR結(jié)合，采用柱后固相提取進(jìn)行富集（post column-SPE），接著將干燥的SPE管中的富集物洗脫到NMR中。與采用昂貴的重氫氧化物來代替水的傳統(tǒng)的LC-NMR技術(shù)不同，LC-SPE-NMR可以與質(zhì)子化的溶劑配合使用。這種方法的特別之處，就是排除了未知化合物中所不希望發(fā)生的疊氮化物質(zhì)在質(zhì)譜圖中的H-D交換，否則將不可避免地導(dǎo)致錯(cuò)誤的質(zhì)量測(cè)定。

如果將高分辨率的質(zhì)譜儀通過一個(gè)裂片集合到體系中，就可以測(cè)定準(zhǔn)確的質(zhì)量由此得出未知組分的化學(xué)總式。如果將高分辨率的質(zhì)譜儀再附加一個(gè)四級(jí)質(zhì)量過濾器進(jìn)行離析，并配置一個(gè)碰撞池，那么除了全掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù)之外，還能準(zhǔn)確測(cè)量在碰撞池中產(chǎn)生的未知化合物的碎片。通過這種方式在應(yīng)用SPE干柱進(jìn)行溶質(zhì)富集的時(shí)候，就已經(jīng)產(chǎn)生了關(guān)于結(jié)構(gòu)方面其它的一些重要信息。

蘋果汁中天然物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析

針對(duì)蘋果汁中所含非極性的組分，采用以苯乙烯二乙烯苯聚合物為填料的經(jīng)典固相萃取方法得到了四倍的富集系數(shù)。這種樣品前處理方法的優(yōu)點(diǎn)在于：可以除掉強(qiáng)極性化合物如醣類或短鏈（脂肪）酸，而直接進(jìn)樣的話將會(huì)對(duì)質(zhì)譜儀的離子源產(chǎn)生快速污染。由此得到的提取液接著被注射到HPLC柱中進(jìn)行分類。將分離過程中屬于未知的次要組分、位于第22min的流出液選擇性地帶到SPE-富集柱中進(jìn)行柱后富集（圖2）。通過具有質(zhì)量選擇性的檢測(cè)器來選擇性地富集質(zhì)/荷比（m/z）為569.188 Th的峰。借助于將小部分的色譜洗脫物連續(xù)地導(dǎo)入高分辨率的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中，從而能夠獲得一種選擇性的信息并作為所提取的離子色譜圖（EIC）加以利用，借此能夠從其混合物中對(duì)這種未知化合物清晰地進(jìn)行鑒定，并實(shí)現(xiàn)自動(dòng)富集。

所得質(zhì)譜圖表明，這種假分子的離子相應(yīng)于化學(xué)總式為C26H33O14，而一種碎片在m/z為275.093 Th相應(yīng)于化學(xué)總式為C15H15O5（見圖2）。這種小的SPE-富集柱可以借助于一種自動(dòng)換柱器卡入到（HPLC）柱后的流路中。SPE-富集柱具有2mm的內(nèi)徑和10mm床厚?？梢赃x用不同的固相材料，除了經(jīng)典的RP-反相材料如C-8、C-18硅基材料之外，還有聚合物材料和離子交換材料。此外正相材料如純的硅膠、氨丙基、氰基以及二醇鍵合相亦屬此列。

對(duì)于極性和中等極性的溶質(zhì)而言，聚合物相非常實(shí)用。為了得到色譜流需要加入四倍于后柱體積的水。通常情況下，根據(jù)在這種SPE柱上產(chǎn)生的保留時(shí)間允許進(jìn)行多次注射來對(duì)同一峰進(jìn)行多次富集（即所謂多次截留）。由此大大提高了可供NMR測(cè)量的溶質(zhì)量。待色譜峰富集之后需要通入氮?dú)庖猿ベ|(zhì)子化的溶劑。經(jīng)過大約30min的干燥，所有殘存水和乙腈的NMR-信號(hào)便被清除干凈達(dá)到可以忽略不計(jì)的程度，然后即可應(yīng)用重氫化的乙腈將富集柱中的溶質(zhì)淋洗到NMR-管中。其淋洗的體積約為20μl，為HPLC-柱洗出體積的十分之一以下。這一體積被一內(nèi)徑為1.7mm的NMR-管所接納，該管的NMR-樣品頭具有大約30μl的活性體積。有別于原來所用5mm內(nèi)徑管和相應(yīng)的600μl體積，這樣可以避免強(qiáng)烈的稀釋作用。
 

后柱SPE-NMR法

后柱SPE-NMR是一種樣品富集方法。涉及樣品在經(jīng)過分析型HPLC色譜柱的分離之后再借助固相萃取管來進(jìn)行富集。色譜柱流出物在UV-檢測(cè)下于“T”-型管中用通過高壓泵輸入的水來稀釋，有關(guān)峰的流出段被轉(zhuǎn)入到具有適當(dāng)材料的富集管中。由于用水進(jìn)行了稀釋，在SPE管中的保留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，由此可以對(duì)所分離的峰進(jìn)行選擇性的富集。待色譜富集完成之后，將富集管用氮?dú)獯蹈?，然后用重氫化的有機(jī)溶劑將其帶到NMR-管中或者導(dǎo)入流通樣品頭中進(jìn)行NMR測(cè)量。所有步驟包括峰的檢測(cè)、富集、干燥以及后到如NMR-管中進(jìn)行測(cè)量都是自動(dòng)進(jìn)行的。