在不同的研究人員中，以抗體為基礎(chǔ)的治療藥物的細胞系開發(fā)過程可能有很大不同。終目標(biāo)是找到可以穩(wěn)定產(chǎn)生大量單克隆抗體的細胞克隆。IgG 產(chǎn)物檢測在開發(fā)和生產(chǎn)單克隆抗體的多個階段都是非常重要的一步 ( 圖 1 )。通常 IgG 定量的方法都需要專門的儀器和技術(shù)人員，例如 HPLC 和表面干涉測量，或是要花費大量時間的 ELISA 檢測 ( 酶聯(lián)免疫吸附實驗 )。盡管 ELISA 是蛋白定量的成熟方法，但它也是一種冗長的、多個步驟的實驗過程 ( 表 1 )。這里，我們向大家介紹使用 Valitacell 公司Valita®TITER實驗來檢測抗體開發(fā)和生產(chǎn)過程中 IgG 的方法。

ValitaTITER 實驗使用簡單“add-and-read”( 添加和讀數(shù) ) 方式測定 2.5 ? 100 mg/L 濃度的 IgG。此實驗過程不到 1 小時即可完成且能夠整合到以 96 孔板為規(guī)格的生物反應(yīng)工作流程中。此實驗可實現(xiàn)高通量和全自動。其過程可在細胞培養(yǎng)基中用少量樣品進行，沒有復(fù)雜的準(zhǔn)備步驟。

可用于實驗檢測的 Molecular Devices 公司多功能微孔讀板機有：SpectraMax®iD5多功能微孔讀板機、帶熒光偏振檢測卡盒的 SpectraMax® i3x 多功能微孔讀板機和 SpectraMax® M5 多功能微孔讀板機。

圖 1 從細胞轉(zhuǎn)染到擴大生產(chǎn)的細胞系開發(fā)過程

優(yōu)點

• 輕松采集數(shù)據(jù)并利用 SoftMax Pro軟件的預(yù)設(shè)模板分析數(shù)據(jù)
• 快速、均相實驗，不超過 1 小時即可獲得結(jié)果
• 2.5-100 mg/L IgG 濃度范圍的測定

表 1 比較 ValitaTITER 實驗與其他方法在 IgG 定量檢測方面的性能表現(xiàn)

實驗原理

ValitaTITER 實驗基于對 IgG Fc 片段與蛋白 G 的相互作用采用熒光偏振 ( FP )技術(shù)檢測。96 孔微滴度板的每個孔中都包被有熒光標(biāo)記的 IgG 結(jié)合多肽，蛋白 G。當(dāng)加入樣品到孔板中時，蛋白G 分子被重懸并發(fā)生結(jié)合。一旦結(jié)合抗體，蛋白 G 分子的運動速率便會下降，導(dǎo)致熒光偏振 ( FP ) 值的增加 ( 圖 2)。

圖 2 ValitaTITER 實驗原理使用 FP 技術(shù)檢測。自由的蛋白 G 分子很小且在緩沖液中快速旋轉(zhuǎn)。結(jié)果是偏振激發(fā)光丟失了偏振性 ( 上圖 )。當(dāng)?shù)鞍?G 分子在樣品中結(jié)合了抗體，較大的復(fù)合體旋轉(zhuǎn)就會減慢導(dǎo)致 FP 值的增加 ( 下圖 )

材料

• ValitaTITER 檢測試劑盒(Valitacell cat. #00010)
• IgG 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 (Sigma cat. #I2511)
• CD CHO 培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific cat. #10743011)
• 實驗過程中的樣品：懸液培養(yǎng)產(chǎn)生CHO 細胞系的重組 IgG 培養(yǎng)上清液
• 安裝有 535-nm FP 發(fā)射濾片的SpectraMax iD5 多功能微孔讀板機
• 帶有熒光偏振 ( FP-FLUO ) 檢測卡盒的 SpectraMax i3x 多功能微孔讀板機
• SpectraMax M5 多功能微孔讀板機

方法

IgG 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋到 CD CHO 細胞培養(yǎng)基中使?jié)舛仍?2.5 和 100 mg/L 之間。細胞培養(yǎng)上清中的一系列 IgG 樣品按需要稀釋到細胞培養(yǎng)基中。加入 60 µLValitaMab 重組緩沖液到 ValitaTITER板的每個孔中，然后再迅速加入 60 µL準(zhǔn)備好的細胞樣品或蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。混勻樣品或標(biāo)準(zhǔn)品并在室溫下避光孵育30 分鐘。在 SpectraMax iD5 讀板機上 使 用 內(nèi) 置 的 光 柵 光 路 激 發(fā) 并 用535-nm 發(fā)射濾片檢測FP 信號。使用SoftMax Pro 軟件中的預(yù)設(shè)模板獲取數(shù)據(jù)并進行分析 ( 圖 3 )。同樣在Spectra-Max i3x 和 SpectraMax M5 讀板機上檢測 FP 以驗證它們的性能表現(xiàn) ( 數(shù)據(jù)未示 )。

用蛋白 A 的 HPLC 數(shù)據(jù)對比。根據(jù)生產(chǎn)廠家操作說明進行實驗。

圖 3 ValitaTITER 實驗流程。(A) ValitaMab 重組緩沖液加入到 ValitaTITER 板的每個孔中。(B) 樣品或 IgG 標(biāo)準(zhǔn)品加入到孔中。(C) 孔板孵育 30 分鐘為結(jié)合的發(fā)生。(D) 使用 SoftMax Pro 軟件在SpectraMax iD5 讀板機上檢測 FP

結(jié)果

ValitaTITER 實驗利用簡單的“add-and-read”( 添加和讀數(shù) ) 方式獲得 IgG 標(biāo)準(zhǔn)曲線，中間無洗滌步驟且只需少量樣品 ( 5-30 µL )。在 SpectraMax iD5讀板機上使用內(nèi)置的光柵激發(fā)光路和535-nm FP 射濾片可獲得*結(jié)果。濃度從 3.1 到 100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品所檢測到的結(jié)果在整個濃度范圍內(nèi)均保持了高度線性 (r 2 = 0.998) ( 圖 4 )。Spectra-Max i3x 和 SpectraMax M5 讀板機也獲得了相似的數(shù)據(jù) ( 數(shù)據(jù)未展示 )。SoftMax Pro 軟件中的預(yù)設(shè)模板可自動計算出 mP 結(jié)果并繪制曲線圖。對進料間歇反應(yīng)器條件培養(yǎng)基樣品的ValitaTITER 實驗結(jié)果與 HPLC 進行了
比較。兩種方法呈現(xiàn)出高度的一致性，r 2 = 0.994 ( 圖 5 )。

圖 4 使用 ValitaTITER 實驗在 SpectraMax iD5 讀板機上生成 IgG 標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)采用SoftMax Pro 軟件中的線性擬合繪制曲線圖 (r 2 = 0.998)。誤差線表示 6 個重復(fù)標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖 5 ValitaTITER 實驗的 IgG 定量結(jié)果和蛋白 A 的 HPLC 分析結(jié)果進行比較。進料間歇生物反應(yīng)器中一系列條件培養(yǎng)基的 IgG 滴度通過 ValitaTITER 熒光偏振實驗進行定量。這些樣品同樣也通過蛋白 A 的 HPLC 進行分析

總結(jié)

IgG 定量必須在細胞系開發(fā)過程的多個步驟中進行以保證終擴大化生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量，因此一種以盡可能少的時間獲得準(zhǔn)確結(jié)果的測定方法對成功至關(guān)重要。這里我們展示了由 ValitaTITER實驗得到的IgG 定量數(shù)據(jù)與 HPLC 的分析結(jié)果高度匹配，后者被廣泛認為是檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，然而前者所需的時間還不到 HPLC 的 3% 。ValitaTITER 實驗是一種均相的、高通量的方法，可在細胞系開發(fā)工作流程中快速的檢測 IgG 含量。這種實驗的96 孔板檢測已在 SpectraMax iD5 讀板機和其他具有 FP 功能的 MolecularDevices 公司讀板機上被充分驗證通過，保證結(jié)果的可靠性。而 SoftMax Pro 軟件則大大減少檢測參數(shù)的設(shè)置時間并自動擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線和計算樣品濃度。