血液氧化應激活性氧光澤精化學發(fā)光法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 血液氧化應激活性氧（ROS）光澤精化學發(fā)光法定量檢測試劑是一種旨在通過使用自由基探針光澤精，捕獲體液中的活性氧族，使發(fā)光物氧化降解并發(fā)光，在化學發(fā)光儀（Luminometer）的幫助下定量檢測樣品中活性氧族（超氧自由基陰離子）的生成和數(shù)量的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體血液樣品包括血漿、血清等活性氧族的檢測。 產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導致細胞衰老或凋亡，甚而導致諸如男性不育、冠心病、風濕性關節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。光澤精（lucigenin），又稱硝酸雙-N-甲基吖啶翁（bis-N-methylacridinium nitrate），是一種帶正電荷的發(fā)光劑，單價還原后生成光澤精自由基，再與超氧自由基陰離子反應生成不穩(wěn)定的中間物光澤精二惡二酮，由此分解成電激發(fā)狀態(tài)（N－甲基丫啶酮），通過釋放光子，回復到基態(tài)。光澤精作為探針，可以特異性檢測體液中超氧自由基陰離子，其發(fā)光強度與超氧自由基陰離子水平成正相關。 

產(chǎn)品內容

 清理液（Reagent A）      20毫升

 發(fā)光液（Reagent B）       1毫升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存 發(fā)光液（Reagent B） 在－20℃冰箱里，嚴格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

抗凝管：用于血液采集的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品操作

測試管或黑色96孔板：用于發(fā)光檢測用的容器

化學發(fā)光儀：用于檢測化學發(fā)光

實驗步驟

• 樣品預處理

選擇一：血漿樣品

• 準備好抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）放進－70℃冰箱里保存
• 放進37℃培養(yǎng)箱里備用（1小時內）

選擇二：血清樣品

• 準備好不含抗凝劑的儲存管
• 抽取1毫升血液，置于儲存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• （選擇步驟）放進－70℃冰箱里保存
• 放進37℃培養(yǎng)箱里備用（1小時內）

• 測讀

測讀開始前，打開化學發(fā)光儀，設定儀器內溫度為37℃預熱和整合測讀10秒或15分鐘；然后關掉實驗室的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴格置于暗室里。然后進行下列操作。

• 準備好測試管，做好標記：陰性對照、樣品本底和樣品活性
• 移取400微升 清理液（Reagent A）到陰性對照測試管
• 移取400微升上述預處理的血液樣品到樣品本底測試管
• 移取400微升上述預處理的血液樣品液到樣品活性測試管
• 分別加入10微升 發(fā)光液（Reagent B）到上述測試管，除樣品本底測試管
• 輕輕渦旋混勻
• 即刻放進37℃化學發(fā)光儀里測讀
• 整合測讀10秒，獲得相對發(fā)光單位（relative light unit；RLU）
• 或者整合測讀15分鐘，獲得光電子讀數(shù)：X 10⁶ CPM（counted photon per minute）（注意：可以使用液體閃爍儀替代）
• 計算ROS水平：

（樣品活性－樣品本底） ÷ 0.4（毫升；樣品容量） ＝相對發(fā)光單位（RLU） / 毫升＝相對發(fā)光單位（RLU）/【（N）X 10⁶ 細胞】＝X 10⁶ CPM/毫升＝X 10⁶ CPM/【（N）X 10⁶ 細胞】

注意事項

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 如果測定體系變化，則試劑用量相應變化
• 操作時，須戴手套
• 測試前，血液樣品須新鮮收集，1小時內為*
• 樣品制備后即刻測讀，不宜過夜保存
• 必要時，例如活性氧族過低，可以濃縮樣品處理
• 測讀的所有步驟均須在暗室里進行
• 如果是注射式化學發(fā)光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗化學發(fā)光儀注射（injector）管道
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感