極威生物植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase ）活性酶耦聯(lián)光度法定量技術(shù)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）活性酶耦聯(lián)光度法定量技術(shù)試劑是一種旨在通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)，即采用光度法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析植物裂解樣品中 PEPCase 活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等、部分或*純化酶樣品中 PEPCase 的定量技術(shù)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate Carboxylase；PEPCase；EC4.1.1.31），屬于羧基裂解酶（carboxylyase）家屬成員之一，同源四聚體，單體110Kd，廣泛存在于植物、原生生物（protist）和細(xì)菌里，位于胞漿，催化碳酸氫固定（bicarbonate fixation）到磷酸烯醇式丙酮酸，產(chǎn)生四碳化合物草酰乙酸，釋放磷酸根的反應(yīng)。在四碳（C4）和景天酸代謝（crassulacean acid metabolism；CAM）等陸生植物（terrestrialplant）中，例如玉米等，其具有催化光合成碳同化作用（assimilation）和有機酸代謝，控制β-羧基化（β-carboxylation）的效率，產(chǎn)生NADPH，調(diào)節(jié)pH和電中性（electroneutrality），生成蘋果酸以及酵解，重新捕獲呼吸產(chǎn)生的二氧化碳等功能；在三碳（C3）或非光合成和四碳類植物中，例如水稻和小麥等，其參與回補反應(yīng)（anaplerotic），為KREBS循環(huán)提供中間產(chǎn)物，并且提供碳類支持氨基酸合成，尤其在植物發(fā)育和種子發(fā)芽時期，調(diào)節(jié)碳和氮代謝相互作用?；诘孜锪姿嵯┐际奖幔诙趸嫉拇嬖谙?，受到磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用，獲得產(chǎn)物草酸乙酰（oxaloacetate），進(jìn)而通過蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase；MDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（ReagentA） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

酶促液（Reagent D） 微升

反應(yīng)液（Reagent E） 微升

底物液（Reagent F） 微升

陰性液（Reagent G） 微升

產(chǎn)品說明書 1 份

保存方式保存清理液（ReagentA）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，避免光照和反復(fù)凍融；有效保證 6月

用戶自備

1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

DOUNCE 勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞

（微型）臺式離心機：用于樣品預(yù)處理

200 微升 1 厘米光徑比色皿或 96 孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實驗步驟

一、 待測樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定 1 克組織重量

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入 xx 毫升 清理液（Reagent A ）清洗 1 次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進(jìn)一個預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管

6． 加入預(yù)冷的 xx 毫升 裂解液 （Reagent B ）

7． 渦旋震蕩 5 秒，充分混勻

8． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的 DOUNCE 勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約 80 下）

9． 將所有組織勻漿物移入 1.5 毫升離心管，放進(jìn) 4℃微型臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 10000g

10．小心移出上清液（注意： 不要觸碰沉淀物 ）到 1.5 毫升離心管

11．移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量技術(shù)（注意： 建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－ GMS30030.1）

12．放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如植物裂解懸液等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長為 340nm，間隔 1 分鐘，讀數(shù) 6 次（共 5 分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C ）室溫下均衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取 xx 微升 緩沖液（Reagent C ）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 酶促液（Reagent D ）

3． 加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent E ）

4． 加入 xx 微升 底物液（Reagent F ）

5． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 xx 微升 陰性液（Reagent G ）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）8． 即刻放進(jìn)分光光度儀技術(shù)，此為背景空對照：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 5 分鐘

四、 樣品測定

1． 移取 xx 微升 緩沖液（Reagent C ）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 酶促液（Reagent D ）

3． 加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent E ）

4． 加入 xx 微升 底物液（Reagent F ）

5． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘

6． 加入 10 微升待測樣品（注意：50 微克植物裂解蛋白；樣品須溶解 ）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀技術(shù)，此為樣品總活性讀數(shù)：340 波長讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長讀數(shù) 5 分鐘

五、 計算樣品活性

六、 酶標(biāo)儀 測定

1． 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品

2． 分別移取 xx 微升 緩沖液（Reagent C ）到 96 孔板里

3． 分別加入 xx 微升 酶促液（Reagent D ）

4． 分別加入 xx 微升 反應(yīng)液（Reagent E ）

5． 分別加入 xx 微升 底物液（Reagent F ）

6． 輕輕搖動 96 孔板

7． 在 30℃溫度下孵育 3 分鐘

8． 分別加入 xx 微升 陰性液（Reagent G ）或待測樣品（50 微克植物裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈 ）

9． 輕輕搖動 96 孔板

10．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀技術(shù)：0 分鐘讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù)

11．活性計算：

注意事項

1． 本產(chǎn)品為 20 次操作，包括背景操作

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需 1 次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 加入樣品啟動反應(yīng)后 3 秒內(nèi)即刻光度測定

7． 測定值由高到低變化；測定可持續(xù) 30 分鐘

8． 光度測定后，比色皿須清洗*

9． 樣本測定 0 分鐘讀數(shù)高于 5 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10．建議待測樣本蛋白濃度為 50 微克/10 微升（本公司提供 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

12．磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性單位濃度定義：在 30℃溫度下，pH 8.0 條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化 1 微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

13．本公司提供系列羧化酶技術(shù)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定技術(shù)敏感

使用承諾

秉著“信譽至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后 10 天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHATYOU DID WRONG 。

訂購信息

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編號 名稱 規(guī)格

GMS16017 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性酶耦聯(lián)光度法定量技術(shù)試劑盒 20 次

GMS16017A 清理液（ReagentA） 毫升

GMS16017B 裂解液（Reagent B） 毫升

GMS16017C 緩沖液（Reagent C） 毫升

GMS16017D 酶促液（Reagent D） 毫升

GMS16017E 反應(yīng)液（Reagent E） 毫升

GMS16017F 底物液（Reagent F） 毫升

GMS16017G 陰性液（Reagent G） 毫升