2016年京都大學(xué)Miyazaki團隊發(fā)現(xiàn)在人hPSC傳代培養(yǎng)期間，可以向細胞懸浮液中添加層粘連蛋白iMatrix-511，這樣可以省略在培養(yǎng)皿上預(yù)包被的過程。在此之前，都*必須要花費數(shù)小時對培養(yǎng)皿進行預(yù)包被以增強細胞附著性。另外，使用非包被法添加iMatrix-511，能減少這種細胞外基質(zhì)的使用量，但功效卻與對培養(yǎng)皿采取預(yù)包被法時相同。后，該團隊還證實了iMatrix-511的添加還能支持hPSC單細胞傳代的長期維持。通過使用非包被的iMatrix-511，hPSC的擴增可以變得更加有效，成本更低且更省時省力。

◆實驗方法

      將hPSC鋪在含有10 μM Y-27632和培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)基中。對于使用iMatrix-511非包被法的一般培養(yǎng)，iMatrix-511的濃度為0.25 μg/cm²。例如，在無任何包被的6孔板的單孔中，加入含5 μL 0.5 mg/mL iMatrix-511母液的2 mL細胞懸浮液，以進行細胞培養(yǎng)。接種后，以TeSR-E8和StemFit AK03培養(yǎng)基培養(yǎng)hESC H9細胞系和hiPSC（人體誘導(dǎo)多能干細胞）253G1細胞系。每4天用0.5×胰酶和5 mM EDTA/DPBS組成的細胞消化液在室溫下處理細胞5 min來進行傳代。培養(yǎng)基的體積為200 μL/cm²。

◆在非包被法下生長的hPSC的特征

      實驗團隊通過一系列方法評估了在非包被法下長期培養(yǎng)的hPSC是否正常。使用iMatrix-511的非包被法，hPSC能連續(xù)傳代，并傳代超過10次。與預(yù)包被法下培養(yǎng)的細胞類似，在非包被法下培養(yǎng)的hPSC增殖良好并保持正常的細胞形態(tài)。此外，它們能高度表達代表性的未分化細胞表面標(biāo)志物SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60和Tra-1-81，并且不表達SSEA-1，表明了其持續(xù)的未分化狀態(tài)與以常規(guī)的預(yù)包被法下生長的細胞相似（圖1a）。團隊對非包被法生長的hPSC進行了qPCR分析，也證明了hPSC處于未分化狀態(tài)。與預(yù)包被法相比，兩者的未分化標(biāo)記基因的表達水平很相似（圖1b），表明了非包被法和預(yù)包被法中生長的hPSC的未分化狀態(tài)幾乎沒有差異。核型分析顯示，非包被法不影響hPSC的穩(wěn)定性（圖1c，補充圖3）。這些結(jié)果表明即使在連續(xù)傳代培養(yǎng)后，非包被法也能維持hPSC的未分化狀態(tài)。后，團隊評估了在非包被法中生長的hPSC分化成不同細胞系的潛力。hPSC可正常形成胚狀體。通過與誘導(dǎo)前的基因表達進行比較，胚狀體對于三胚層特異的標(biāo)記基因的表達會高度上升，表明它們保持著分化潛力（圖1d）。因此，團隊得出結(jié)論，在非包被法下生長的hPSC能維持其多能性，并且非包被法可以應(yīng)用于hPSC日常的連續(xù)傳代培養(yǎng)。

圖1. 　在非包被法下生長的hPSC的特征。

（a）具代表性的未分化標(biāo)記物的流式細胞分析。途中灰色陰影區(qū)域為陰性對照。

（b）未分化標(biāo)記基因的qPCR分析。圖中顯示了非包被法下生長的經(jīng)29次傳代的hPSC與在預(yù)包被法下生長的經(jīng)10次傳代的hPSC的相對表達。

（c）G帶正常核型分析。hESC H9細胞系具有正常的核型（46，XX）。

（d）用于胚狀體分化的標(biāo)記基因的qPCR分析。hPSC在非包被法下培養(yǎng)，然后用14天將其誘導(dǎo)成胚狀體。通過分析TaqMan hPSC Scorecard 序列檢測的單組數(shù)據(jù)，將具代表性的分化標(biāo)記基因的表達與胚狀體形成前該基因的表達進行比較，結(jié)果表示如圖所列的基因組的表達有著超過兩倍的增長。數(shù)據(jù)是從在非包被法下生長了10代的hPSC中收集的。

◆結(jié)論

      iMatrix-511在作為培養(yǎng)基補充劑，添加時能有效地支持細胞粘附，但它可以不通過預(yù)包被法來實現(xiàn)。與其他的基質(zhì)蛋白不同，與預(yù)包被法相比，非包被法中iMatrix-511以低得多的濃度來支持細胞粘附和長期擴增。這種使用iMatrix-511的新方法可以降低hPSC維持的成本和時間。

◆參考文獻

Miyazaki, Takamichi , et al. "Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner." Scientific Reports 7(2017):41165.

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