酶聯(lián)免疫吸附的原理與方法
1. 1  原理
酶聯(lián)免疫吸附測定的基本原理是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預先結合到某種固相載體表面; 測定時, 將受檢樣品( 含待測抗體或抗原) 和酶標抗原或抗體按一定程序與結合在固相載體上的抗原或抗體起反應形成抗原或抗體復合物; 反應終止時, 固相載體上酶標抗原或抗體被結合量( 免疫復合物) 即與標本中待檢抗體或抗原的量成一定比例; 經洗滌去除反應液中其他物質, 加入酶反應底物后, 底物即被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a物, zui后通過定性或定量分析有色產物量即可確定樣品中待測物質含量[ 2] 。
1. 2  方法
ELISA 試劑盒常用的測定方法主要有直接法和間接法兩種: 直接法是酶標記抗體與待檢測樣本中固相抗原直接作用, 加入底物后, 顯色( 其顏色深淺與樣本中抗原量成正比) ; 間接法是使已知抗原吸附在固相載體上, 與待檢測樣本中的抗體作用, 再加入酶標記抗同種動物抗體的免疫球蛋白( 抗抗體) , 使與特異抗原抗體復合物中的抗體作用, 加入酶底物, 顯色( 顏色深淺與樣本中抗體量成正比) [ 1] 。ELISA 有許多改良方法, 如雙抗體法( sandwichELISA) 、雙抗體夾心法( double_antibody sandwichtechnique) 、競爭法、酶- 抗酶法和均質法( homogeneousELISA) 、生物素- 親和素放大系統(tǒng)( biotina-vidin system, BAS) ELISA 及斑點_ELISA ( dot_ELISA)等, 大致可分為三類: ( a) 測定抗體的間接法; ( b)測定抗原的雙抗體夾心法: ( c) 測定抗原的競爭法[ 3] 。前兩種方法主要用于測定抗體和大分子抗原, 適用于臨床診斷上, 而競爭法是測定小分子抗原的方法, 因而尤其適用于食品分析。競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法又可分為直接競爭法和間接競爭法。直接競爭法主要有三步: 抗體吸附于固相載體, 溫育后清洗?? 加入含有抗原的待測液及酶標記的抗原, 溫育后清洗?? 加入酶底物溫育后顯色, 判斷結果。間接競爭法主要有四步: 抗原吸附于固體載體, 溫育后清洗??加入含有抗原的待測液和抗體, 溫育后清洗?? 加入酶標記抗體, 溫育后清洗?? 加入酶底物溫育后顯色, 判斷結果[ 4] 。