ELISA試劑盒HRP的制備方法
1).水提?。悍Q取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP),用菜刀切成小碎塊,在絞肉機中絞碎1~2次。碎渣漿用1倍體積的水低溫下攪拌提取過一夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(或離心機)甩干,收集濾液,碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次,合并2次濾液,測得總體積。
2).硫酸銨分級分離:在不斷攪拌下,每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當(dāng)于0.40飽和度,0℃),大約在1~2h內(nèi)加完,置冷室中放置過一夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出,下面混濁液以3 000r/min離心15min,棄沉淀,合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌,當(dāng)硫酸銨全部溶解后,置冷室過一夜。次日,虹吸出上清液,沉淀部分在冰凍離心機中以13000r/min離心20min,棄去上清液,收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止),分裝于透析袋內(nèi),放在流動自來水中進行透析1~2天,直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢查)。然后改換成用蒸餾水透析,中間更換2~3次,用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為止。將透析液合并,在冰凍離心機中以4 000r/min離心15min,棄去沉淀,量上清液的體積。
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