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高分辨SID-EMR Orbitrap儀器研制及大蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)測定

來源:上海斯邁歐分析儀器有限公司   2019年03月09日 10:03  

近日俄亥俄州立大學(xué)化學(xué)和生物化學(xué)系的VickiH. Wysocki教授課題組在AC上發(fā)表了一篇文章,題目為Surface-InducedDissociation of Noncovalent Protein Complexes in an Extended Mass RangeOrbitrap Mass Spectrometer。


獲取蛋白質(zhì)復(fù)合物的四級結(jié)構(gòu)信息,對于理解其生物功能來說至關(guān)重要。與傳統(tǒng)的CID/HCD通過多次碰撞沉積能量以實現(xiàn)解離相比,表面誘導(dǎo)解離(Surface induceddissociation,SID)是通過使復(fù)合物離子撞擊一個具有化學(xué)惰性、剛性的表面,經(jīng)過單次高能撞擊后,產(chǎn)生相比于CID和HCD技術(shù)電荷更均勻分布的蛋白亞基,從而提供化學(xué)計量比和互作網(wǎng)絡(luò)等信息。此外,相比于CID常常導(dǎo)致小分子配體丟失,SID可以產(chǎn)生保留小分子配體的復(fù)合物亞基。

 

目前,SID技術(shù)在蛋白復(fù)合物方面的工作主要是在飛行時間質(zhì)譜(TOF MS)上完成,但隨著蛋白復(fù)合物的分子量越來越大,結(jié)構(gòu)解析深度越來越深入,對質(zhì)譜儀器的分辨率也提出了更高的要求。每一種類型的質(zhì)量分析器(TOF、FTICR或者Orbitrap)都有它們的優(yōu)劣勢,而儀器的選擇主要依賴于待解決的問題本質(zhì)。為此,Vicki H. Wysocki課題組與賽默飛公司Alexander A. Makarov博士合作,將SID解離源裝配到Exactive Plus Extended Mass Range(EMR)Orbitrap儀器上(如圖2)。這套SID即可用來傳輸離子又可用來進(jìn)行SID。值得一提的是,SID裝置并未影響離子進(jìn)入HCD池和一級質(zhì)譜分析。

 

隨后,作者利用該儀器對Streptavidin和L-GlutamateDehydrogenase蛋白復(fù)合物進(jìn)行了質(zhì)譜分析。其中,前者是具有D2對稱性的同源四聚體,后者是具有D3對稱性的同源六聚體。圖3為Streptavidin的一級譜及其SID譜圖。先前的文獻(xiàn)表明,通過CID主要產(chǎn)生的是streptavidin復(fù)合物的去折疊單聚體和三聚體,但這一結(jié)果顯然不能支持streptavidin是由同源二聚體組成的結(jié)構(gòu)。而11+的母體streptavidin復(fù)合物經(jīng)過SID會解離成兩個二聚體,分別為5+和6+,證明SID更能反映他們真實的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖3a-c)。值得一提的是,之前對于譜圖中出現(xiàn)的3+單聚體和6+同源二聚體,由于TOF MS分辨率不高所以要依靠IMS才能進(jìn)行分辨3,但現(xiàn)在EMR Orbitrap在高分辨率模式(R=140,000 at m/z 200)下就可直接對它們二者進(jìn)行分辨(圖3d),甚至鹽加和離子或者N末端Met修飾與否都可以在高分辨譜圖中*獲得(圖3e)。


a)Streptavidin四聚體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(PDB ID:1SWB),b)Streptavidin四聚體一級質(zhì)譜圖,c)11+價態(tài)Streptavidin四聚體的SID譜圖(45 V,495 eV),d)高分辨率模式下3+價態(tài)Streptavidin單聚體和6+價態(tài)的二聚體,e)3+價態(tài)單聚體和6+價態(tài)二聚體的N末端蛋氨酸修飾和Na離子加和譜圖。


此外,作者還考察了L-Glutamate Dehydrogenase同源六聚體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。HCD結(jié)果表明,該六聚體很難在氣相中發(fā)生解離,需要較高HCD能量和高電荷態(tài),常常導(dǎo)致先失去一個去折疊單體,無法真實反映亞基組成。而通過SID可以獲得比較穩(wěn)定的三聚體信號,反映出L-GlutamateDehydrogenase同源六聚體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)主要為三聚體-三聚體界面,在低能量下主要斷裂較弱的三聚體界面(圖4a),當(dāng)能量逐漸升高單體會從三聚體亞基中解離出來(圖4b)。


綜上所述,相比于SID-TOF MS儀器,具有更高質(zhì)譜分辨率的SID–EMR Orbitrap儀器后續(xù)將為大蛋白復(fù)合物提供更豐富的四級結(jié)構(gòu)信息。此外,Vicki H. Wysocki課題組先前還報道了將SID裝載到FTICR-MS儀器,在SID譜圖中可對霍亂毒素(Cholera toxin B,CTB)多種亞基進(jìn)行同位素分辨(R=210,000 at m/z 5803.7),例如8+四聚體、6+三聚體、4+二聚體和2+單聚體4,感興趣的學(xué)者們可進(jìn)一步了解。得益于Orbitrap和FTICR的超高質(zhì)量分辨率,相信SID源將在蛋白-蛋白、蛋白-金屬離子、蛋白-小分子配體復(fù)合物體系中發(fā)揮越來越重要的作用。

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