HUVEC-人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 

★CQ★實(shí)驗(yàn)材料-新生兒臍帶

試劑： PBS、膠原酶、M199培養(yǎng)基、胰酶、EDTA、DMEM培養(yǎng)基。

儀器、耗材：針頭、手術(shù)鉗、離心管、低溫離心機(jī)、彎管、明膠、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡。

★CQ★步驟：

1.將 15-20cm 長的新生兒臍帶放入無菌的 PBS 溶液中儲(chǔ)存。（注：4℃下多貯存 24 小時(shí)，室溫下不超過 6 小時(shí)，否則廢棄）

2. 用一個(gè)鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗 3-5 次，將污血沖洗干凈為止。

3. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入 15ml 的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化 15-20分鐘，并不時(shí)上下?lián)u動(dòng)臍帶。

4. 消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入一個(gè) 50 ml 無菌離心管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗臍帶 2-3 次。

5. 將收集液離心（2000 轉(zhuǎn)/ 分）3 分鐘。

6. 倒去上清，加入 10ml M199 培養(yǎng)基（加入 10U/ml 的 bFGF） ，用彎管吹散細(xì) 胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個(gè)用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。（注：每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入 3- 4ml 無菌的 1%的明膠溶液，搖勻使得明膠溶液* 鋪滿瓶底，放入 37℃孵育，少 2 小時(shí)，用前將明膠溶液倒了即可，明膠包被 有利于細(xì)胞貼壁。 ）

7. 培養(yǎng) 24 小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，并用無菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次，洗掉紅細(xì) 胞和死細(xì)胞，加入 10 ml 新鮮的 M199 培養(yǎng)基。

8. 以后每 2 天換一次培養(yǎng)基（每次換掉 2/3 的培養(yǎng)基） 。

9. 一般培養(yǎng) 5-7 天，細(xì)胞可長滿至 80-90%單層，這時(shí)可以傳代。

10. 倒掉培養(yǎng)基，用無菌的PBS 溶液清洗 2-3 次，加入2- 3ml 消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

11. 用彎管將細(xì)胞吹打下來，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè) 50 ml 無菌離心管中，2000 轉(zhuǎn)/分，離心 3 分鐘。

12. 倒掉上清，加入 10ml新鮮培基，一般一瓶細(xì)胞可傳代 3-4 瓶，以后照此傳代培養(yǎng)。

13. 一般傳代 2-3 代（培養(yǎng)了 20 天左右）用于做各種實(shí)驗(yàn)效果zui佳。