上海銘博生物實驗室介紹：通道載玻片內(nèi)細胞培養(yǎng)方法

本應(yīng)用簡報說明了如何在細胞培養(yǎng)微通道內(nèi)生長貼壁細胞。將描述細胞接種，培養(yǎng)基交換和光學(xué)性質(zhì)。另外，顯示了細胞培養(yǎng)通道和標準開放孔格式之間的主要差異。

為了顯示細胞接種和μ-Slide處理，使用μ-Slide VI 0.4進行演示。像通常方法一樣制備細胞懸液（例如3×105細胞/ ml）并將30μl加到通道中。將移液管放在通道的入口上，并如圖所示指向通道?？焖俜峙洳⑻畛湔麄€渠道。

細胞附著后，如上圖所示，將60μl無細胞培養(yǎng)基填充到每個通道中。注意避免氣泡。如果在細胞粘附后進行填充步驟，則不會將細胞沖洗出通道。如果您想在細胞接種后立即填充通道，請小心移液。
 

μ-Slide VI 0.4在顯微鏡觀察時已充滿細胞和培養(yǎng)基。

填充μ-Slide VI 0.4的Luer儲液孔。
 
2.培養(yǎng)基交換
a.連續(xù)介質(zhì)交換 - 推薦使用
對于連續(xù)介質(zhì)更換，首先從儲存器中移除舊介質(zhì)。然后，將適量的新鮮培養(yǎng)基加入一個儲液器中，同時從另一個儲液孔中吸出。小心使用細胞培養(yǎng)移液器。我們建議體積至少是通道容積的3倍。重新填充儲液器。
 
連續(xù)交換介質(zhì)體積為3倍的介質(zhì)。
 
b.*的培養(yǎng)液交換 - 僅適用于昂貴的液體
 
如果僅僅更換通道內(nèi)液體，請先清空通道。然后，將移液管放在通道入口上，并小心地將液體從通道中吸出。使用細胞培養(yǎng)移液器*清除所有液體。為了重新填充通道，將通道容量的新鮮介質(zhì)直接注入通道。避免產(chǎn)生氣泡。重新填充兩邊的蓄液孔。
 
*清空通道可能導(dǎo)致重新填充后形成氣泡。
 
通道和儲存孔液體*替換。
 
 
3.通道載玻片與多孔載玻片
在下面部分，我們將μ-Slide VI 0.4（細胞培養(yǎng)通道）的特性與μ-Slide 8孔（開放格式）進行比較。

對于接種細胞，主要差異是結(jié)構(gòu)內(nèi)部液體的高度。兩個系統(tǒng)的小區(qū)域部分如下所示。μ-Slide VI 0.4通道內(nèi)部底部和頂部之間的距離為400μm。填充的μ-Slide 8孔載玻片沒有頂部結(jié)構(gòu)。在8孔載玻片里面，培養(yǎng)基約為0.3毫，通道載玻片比開放格式8孔載玻片薄7.5倍。
 
對于細胞接種，必須應(yīng)用不同的細胞密度以在表面上獲得相同量的細胞。在該示例中，目標是接種25個細胞/單位面積。由于μ-Slide 8孔內(nèi)液體的高度是7.5倍，因此應(yīng)用的細胞濃度必須低于相同的因子。
 
 
基于不同高度的液體內(nèi)部μ-Slide VI 0.4和μ-Slide 8孔。在上面的例子中，相同的生長區(qū)域和細胞數(shù)量但不同的體積導(dǎo)致所需的細胞濃度不同。
 
 
為了獲得相當程度的融合，我們建議使用3 ... 7 x 105細胞/ ml（μ-Slide VI 0.4）和4 ... 9 x 104細胞/ ml（μ-Slide 8孔）。這是兩個幾何形狀之間相同的~7.5倍。細胞粘附后，每單位面積的細胞數(shù)相同。
 
由于不同的高度，不同的細胞濃度產(chǎn)生相同等級的細胞聚合。
 
4.通道μ-Slide的優(yōu)點
與標準開孔格式相比，通道載玻片具有很強的優(yōu)勢。
 
a.相差顯微成像效果更好
通道幾何結(jié)構(gòu)很方便使用相差顯微鏡，因為沒有凹液面的影響，整個生長區(qū)域可以用相差技術(shù)觀察。

與開放式多孔載玻片不同，通道載玻片不會干擾相差顯微鏡的光束路徑，從而獲得更好的相差效果。
 

開放式多孔培養(yǎng)板(圖a,圖b)：凹液面影響了了相差效果。只有中心部位能提供高質(zhì)量的對比度。
 
通道式載玻片(圖c,圖d)：在通道幾何結(jié)構(gòu)中，光束路徑始終對齊。整個視野都可以提供高質(zhì)量的相差顯微鏡成像。
 
 
b.細胞分布均勻
 
在通道中，因為邊緣效應(yīng)小，貼壁細胞的同質(zhì)性要好得多。
 
下面的顯微圖像，相差（a）和熒光（b）模式中顯示了開放孔（1-3）中細胞分布的不均勻性和細胞培養(yǎng)通道（4-6）中的同質(zhì)性。
 

1     開放式多孔載玻片，邊緣位置成像
2     開放式多孔載玻片，隨機位置成像
3   開放式多孔載玻片，中心部分
4     通道載玻片，邊緣位置成像
5     通道載玻片，隨機位置成像
6   通道載玻片，中心位置成像