1. 抗原的制備

標準菌株的選擇：所用的菌種傷寒桿菌H901和傷寒桿菌O901應(yīng)具有典型形態(tài)菌落及生化反應(yīng)。在生理鹽水中不發(fā)生自身凝集，與特異血清有高度凝集者可作為菌種。

2. 菌液的制備

1) 原液制備：

H菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株接種于普通瓊脂的克氏瓶或大試管內(nèi) 37℃孵育18—24小時。肉眼觀察有無雜菌生長，必要時作鏡檢。用無菌甲醛生理鹽水洗下菌苔，將洗下液體裝入無菌試管內(nèi)，置37℃恒溫箱18—24小時以殺菌。得到原液。用作無菌試驗即將菌液接種于肉湯及瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)4天，無活菌生長者才可使用。
菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株依上法培養(yǎng)后，用無菌0.5%石灰酸鹽水將菌苔洗下，洗液裝入無菌試管置于37℃溫箱中18—24小時殺菌得原液。經(jīng)檢查無菌時可以使用(如無傷寒桿菌O菌株也可用H菌株制備O抗原。即用0.5%石灰酸生理鹽水洗下H菌菌液置100℃水浴60分鐘，破壞其H抗原即為O菌液。

2) 應(yīng)用液的制備：

合格的原液用標準比濁管計算含菌落數(shù)目后，用生理鹽水稀釋至每毫升含菌10億。是為了應(yīng)用液加入適量甲醛使其為0.25%，制備好的原液及應(yīng)用液均保存在2—10℃冰箱中備用，有效期為1年。
菌液濃度的計算及稀釋法：
菌液的濃度可用麥克倫特氏標準比濁法來測定，方法如下：

a. 分別配制1%硫酸溶液及1%氯化鋇溶液

b. 取口徑相等質(zhì)地相同的試管10支，依下表所示分別將硫酸及氯化鋇溶液加入，封固管口，注明號碼備用。
管號12345678910
1%BaCl2(ml)0.10.20.30.40.50.60.70.80. 91.0
1%H2SO4(ml)9.99.89.79.69.59.49.39.29.19.0
相當菌數(shù)(億/ml)36912151821242730

c. 將洗下的細菌原液放入與比濁管相同的試管中并予以一定稀釋。與標準比濁管相比較，視其濁度相當于比濁管的第幾管，然后將比濁管相當菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即可得到每毫升中所含細菌的數(shù)量。如細菌原液1：5稀釋后其濁度與第3管相當，則原液每毫升含菌數(shù)為9ⅹ5=45億。

d. 菌液的稀釋

3．免疫方法

   1) 選擇體重2—3千克的健康雄兔2—3只，由耳靜脈采血1毫升，分離血清。與進行免疫用的細菌做凝集試驗，測定有無天然凝集素。如無或微量時，該動物可用于免疫。
   2) 將已稀釋的抗原按以下劑量及程序注入兔耳靜脈。
日期第1天第5天第10天第15天第20天
注射劑量0.5ml、1ml1、5ml、2ml、2.5ml
   3) 末次注射后7天耳靜脈采血1毫升，分離血清。用上述菌液作試管凝集試驗，滴定抗菌血清中抗體的效價，效價在1：2000以上可放血。若效價不高可再增量注射菌液1—2次，再行試血。試血合格可頸動脈放血(方法見附錄)。分離血清，加入防腐劑(如萬分之一的硫化汞)放4℃保存?zhèn)溆谩?/span>