上一期中我們簡單介紹了Orbitrap Exploris™ 480的設(shè)計(jì)原則和硬件性能，在這期的微信稿中我們一起來領(lǐng)略一下Exploris 480的強(qiáng)悍性能，以及新的軟件特性如何將蛋白質(zhì)組學(xué)推向一個(gè)新的高度。

1.Orbitrap Exploris™ 480的鑒定性能

Exploris 480是在Q Exactive HF-X的基礎(chǔ)上改進(jìn)而來，因此其性能指標(biāo)也是達(dá)到了新的高度。其高掃描速度為40Hz，與Q Exactive HF-X一致。相比Q Exactive HF-X，Exploris 480有著更高的分辨率和靈敏度，更寬的質(zhì)量范圍和更為豐富的定量模式和選裝模塊。

性能指標(biāo)

性能：強(qiáng)悍的性能指標(biāo)帶來的是不斷突破記錄的鑒定能力

上樣500ng – 1μg Hela全細(xì)胞酶解產(chǎn)物，單針60分鐘的梯度可實(shí)現(xiàn)超過5,000個(gè)蛋白的鑒定（圖1）。

圖1. 60分鐘梯度Exploris 480的蛋白鑒定數(shù)量

非標(biāo)定量

在Hela細(xì)胞樣品中摻入酵母樣品來考察非標(biāo)記定量的準(zhǔn)確性亦得到了非常優(yōu)良的結(jié)果，由于動(dòng)態(tài)范圍和譜圖質(zhì)量的提升，在非標(biāo)記定量的實(shí)驗(yàn)中“Match Between Runs”組件的效果得到了更加明顯的體現(xiàn)（圖2）。

圖2. Orbitrap Exploris™ 480進(jìn)行非標(biāo)記定量的性能評(píng)估（點(diǎn)擊查看大圖）

2.兼容全新一代FAIMS Pro，進(jìn)一步提升定性定量能力

在2018年9月份的HUPO上，賽默飛推出了全新一代的FAIMS Pro (High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry, 高場非對(duì)稱波形離子遷移譜)，該接口可搭載于TNG系列的質(zhì)譜儀，例如Orbitrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀。搭載該接口可顯著提升質(zhì)譜的定性定量能力，一經(jīng)面世即受到市場的熱捧。

Orbitrap Exploris™ 480也采用了TNG式樣的離子源，因此可以選配FAIMS Pro來進(jìn)一步提升儀器能力。FAIMS Pro是一種大氣壓條件下的離子遷移譜，對(duì)于肽段樣品來說主要通過肽段帶電性質(zhì)的不同來進(jìn)行分離，從而作為一種在線的氣態(tài)樣品分級(jí)手段來提高復(fù)雜樣品的定性和定量效率（具體內(nèi)容請(qǐng)見相關(guān)閱讀）[1, 2]。將FAIMS Pro作為在線分級(jí)手段分別用-40CV/-55CV/-65CV進(jìn)行60分鐘采集的話可輕松實(shí)現(xiàn)54,000+個(gè)unique peptide, 對(duì)應(yīng)6,300+個(gè)蛋白的鑒定。

3.的TMT定量體驗(yàn)

困擾：對(duì)于10標(biāo)以及11標(biāo)的TMT定量來說我們一直受到兩個(gè)問題的困擾。

1個(gè)問題

10標(biāo)TMT的相鄰報(bào)告離子基團(tuán)僅存在質(zhì)量虧損級(jí)的質(zhì)量差異，因此我們需要采用50,000的分辨率進(jìn)行采集，從而使得掃描速度變慢，降低了對(duì)樣品的測序深度。

2第二個(gè)問題

共流出肽段的干擾，由于Q Exactive系列儀器無法采集三級(jí)質(zhì)譜，因此我們只能在采集二級(jí)質(zhì)譜時(shí)通過減小母離子隔離窗口，并且關(guān)閉APD選項(xiàng)，然后在數(shù)據(jù)后處理時(shí)篩選干擾小于25%的二級(jí)譜圖來進(jìn)行TMT定量從而盡可能的緩解這一影響。

解決：這一系列問題在Orbitrap Exploris™ 480上都給出了的解決辦法。

1對(duì)于個(gè)問題

對(duì)于個(gè)問題, Exploris 480上搭載了Turbo-TMT選項(xiàng)，該選項(xiàng)實(shí)現(xiàn)了在低分辨采集模式下（Res = 15,000）通過ΦSDM的譜圖后處理算法使得報(bào)告離子的分辨率達(dá)到了50,000，從而輕松區(qū)分僅存在質(zhì)量虧損級(jí)差異的報(bào)告離子（圖3）。這樣就實(shí)現(xiàn)了在不影響報(bào)告離子分辨率的情況下極大的提升了譜圖掃描的速度，從而保證了復(fù)雜樣品的測序深度。

圖3. Turbo-TMT選項(xiàng)的工作流程示意（點(diǎn)擊查看大圖）

2對(duì)于第二個(gè)問題

而對(duì)于共流出肽段干擾的問題，Exploris 480給出了兩個(gè)非常聰明的解決辦法。一是Precursor Fit的二級(jí)觸發(fā)選項(xiàng); 二是FAIMS Pro用于基于價(jià)態(tài)的肽段分級(jí)。Precursor Fit選項(xiàng)通過一級(jí)質(zhì)譜的數(shù)據(jù)計(jì)算目標(biāo)母離子在隔離窗口的含量，只有當(dāng)目標(biāo)母離子的含量超過閾值（一般為75%）時(shí)才會(huì)觸發(fā)二級(jí)（圖4）。這樣使得母離子會(huì)盡可能在其色譜洗脫峰的頂端來進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的采集，一來縮短離子注入的時(shí)間，加快掃描速度，二來通過減少干擾來獲得更為準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。

圖4. Precursor Fit選項(xiàng)的工作流程示意圖（點(diǎn)擊查看大圖）

共流出肽段的干擾一般都來自于不同價(jià)態(tài)的肽段，而FAIMS Pro作為一個(gè)針對(duì)價(jià)態(tài)的在線分級(jí)手段毫無疑問可以緩解共流出肽段干擾這一問題。采用TMT11標(biāo)的敲除了不同基因的酵母樣品進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)啟用了Turbo-TMT, Precursor Fit和FAIMS Pro選項(xiàng)后顯著提升了樣品的定量深度和準(zhǔn)確性（圖5）。

圖5.Turbo-TMT, Precursor Fit和FAIMS Pro選項(xiàng)提升TMT定量的深度和準(zhǔn)確性（點(diǎn)擊查看大圖）

本期新品連載介紹了 Orbitrap Exploris™ 480質(zhì)譜儀的定性能力，F(xiàn)AIMS Pro可選組件以及對(duì)TMT定量的改進(jìn)。

這就夠了嗎？不，Orbitrap Exploris™ 480帶來的驚喜遠(yuǎn)不止于此！

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參考文獻(xiàn)：

1.Hebert, A.S., et al., Comprehensive Single-Shot Proteomics with FAIMS on a Hybrid Orbitrap Mass Spectrometer. Anal Chem, 2018. 90(15): p. 9529-9537.

2.Pfammatter, S., et al., A Novel Differential Ion Mobility Device Expands the Depth of Proteome Coverage and the Sensitivity of Multiplex Proteomic Measurements. Mol Cell Proteomics, 2018. 17(10): p. 2051-2067.

3.Bruderer, R., et al., Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics, 2015. 14(5): p. 1400-10.

4.Peterson, A.C., et al., Parallel reaction monitoring for high resolution and high mass accuracy quantitative, targeted proteomics. Mol Cell Proteomics, 2012. 11(11): p. 1475-88.

5.Meier, F., et al., BoxCar acquisition method enables single-shot proteomics at a depth of 10,000 proteins in 100 minutes. Nat Methods, 2018. 15(6): p. 440-448.

6.Gallien, S., S.Y. Kim, and B. Domon, Large-Scale Targeted Proteomics Using Internal Standard Triggered-Parallel Reaction Monitoring (IS-PRM). Mol Cell Proteomics, 2015. 14(6): p. 1630-44.