ATCC菌株生產(chǎn)商 ATCC原代菌株 開學(xué)3折*

　ATCC菌株轉(zhuǎn)染的方法主要有三種，分別是磷酸鈣-DNA 共沉淀法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo) DNA 轉(zhuǎn)染法，今天師兄就先從磷酸鈣-DNA共沉淀法講起。
磷酸鈣-DNA共沉淀法

　　核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現(xiàn)時(shí)，可使 DNA 附在菌株表面，這回利于菌株吞入攝取核酸，或通過菌株膜脂相收縮時(shí)裂開的空隙進(jìn)入菌株內(nèi)，進(jìn)入菌株的DNA，僅有1%～5%可以進(jìn)入菌株核中，其中僅有不到1%的DNA可以與菌株 DNA 整合，在菌株中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項(xiàng)技術(shù)可以用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動(dòng)物進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)或長期轉(zhuǎn)化的研究。該方法往往被用于貼壁菌株的轉(zhuǎn)染，也是的方法。

1. 試劑的配制

(1)2×HBS 1.63 g NaCl ； 1.19g Hepes； 0.023 g Na2 PO4 ·2H2 O； 加水至100 ml pH 7.1 過濾，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA，1mmol/L Tris-HCL PH 8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2 O至10mL過濾除菌4℃保存。

(5)G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200～ 800mg/L

注意：對(duì)受體菌株先做預(yù)試驗(yàn)，選用濃度為在10～14天內(nèi)能殺死菌株50%以上的zui低濃度。

2. 操作步驟

(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受體ATCC菌株的培養(yǎng)：研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類Alu序列的動(dòng)物菌株系作為受體菌株。如小鼠NIH3T3胚成纖維菌株系等，該菌株有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向，一般在轉(zhuǎn)染前一天接種菌株，接種密度為2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2 培養(yǎng)，待菌株占50～70%瓶底面積時(shí)，用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備

①將供體菌株DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時(shí)向供體菌株DNA液200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混勻30秒。

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體菌株。

(4)轉(zhuǎn)染受體菌株

①將處于對(duì)數(shù)生長期已占瓶底50～70% 的受體菌株，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml（25ml培養(yǎng)瓶）。

②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養(yǎng)液的菌株瓶中搖勻。

③置37℃ 5% CO2 培養(yǎng)24h或更長，使菌株充分吸入DNA-磷酸鈣結(jié)晶顆粒。

④更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。

⑤更換濃度 800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。同時(shí)設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對(duì)照菌株。

⑥培養(yǎng)大約3～5天，對(duì)照菌株大部分死亡，這時(shí)轉(zhuǎn)染菌株更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每3～4天更換一次選擇培養(yǎng)基。

⑦ 2 周后，對(duì)照ATCC菌株死亡，在轉(zhuǎn)染的菌株瓶中可見有抗藥性的菌株克隆出現(xiàn)，待其增大后再進(jìn)行化和擴(kuò)大培養(yǎng)，可建立轉(zhuǎn)化菌株株，并做進(jìn)一步鑒定。

今天就到這里，下期我會(huì)講講 DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法。

ATCC菌株 700323 ATCC原代  

白色假絲酵母/白色念球菌 ATCC 10231
鮮綠青霉 ATCC 10515
桔青霉 ATCC 1109
蠟樣芽孢桿菌 ATCC 11778
福氏志賀氏菌（Shigella flexneri） ATCC 12022
表皮葡萄球菌 ATCC 12228
敗毒梭菌Clostridium septicum ATCC 12464
陰溝腸桿菌 ATCC 13047
產(chǎn)氣莢膜梭菌 ATCC 13124
熒光假單胞菌 ATCC 13525
嬰兒雙歧桿菌 ATCC 15697
短雙歧桿菌 ATCC 15700
青春雙歧桿菌 ATCC 15703
黑曲霉 ATCC 16404
惡臭假單胞菌 ATCC 17485
單增李斯特氏菌 ATCC 19111
溶組織梭菌Clostridium histolyticum  ATCC 19401

ATCC菌株 700323 ATCC原代  
生孢梭菌 ATCC 19404
破傷風(fēng)桿菌/梭菌Clostridium tetani  ATCC 19406
化膿性鏈球菌 ATCC 19615
黃桿菌屬 ATCC 21047
近平滑念珠菌 ATCC 22019
變異鏈球菌 ATCC 25175
脆弱擬桿菌 ATCC 25285
洋蔥假單胞菌 ATCC 25416
大腸埃希氏菌 ATCC 25922
金黃色葡萄球菌 ATCC 25923
宋內(nèi)氏志賀氏菌（Sh.sonnei） ATCC 25931
金黃色葡萄球菌 ATCC 27217
創(chuàng)傷弧菌 ATCC 27562
銅綠假單胞桿菌（綠膿桿菌） ATCC 27853
糞腸球菌 ATCC 29212
金黃色葡萄球菌 ATCC 29213
兩歧雙歧桿菌 ATCC 29521
多形擬桿菌 ATCC 29741
糞腸球菌 ATCC 33186
空腸彎曲菌 ATCC 33291
金黃色葡萄球菌 ATCC 33591
大腸埃希氏菌 ATCC 35218
屎腸球菌 ATCC 35667
變異鏈球菌 ATCC 35668
遲緩真桿菌/遲緩埃格特菌 ATCC 43055
金黃色葡萄球菌 ATCC 43300