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細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

來源:杭州仟諾生物科技有限公司   2019年08月30日 09:42  

細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 

1. 細(xì)胞培養(yǎng)(HEK293T) 
1) 顯微鏡下觀察細(xì)胞,細(xì)胞生長狀態(tài)良好,去上清; 
2) 加入預(yù)熱的PBS 3ml, 溫柔地清洗細(xì)胞,棄去PBS; 
3) 用胰蛋白酶消化細(xì)胞,通常75cm2 培養(yǎng)瓶的貼壁細(xì)胞用3ml 胰蛋白酶于37oC 
處理5min; 
4) 待細(xì)胞脫落后,加入5ml DMEM 培養(yǎng)液(含10%FBS)以終止消化反應(yīng),并將 
細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入15ml 或50ml 離心管中; 
5) 1000rpm 離心5min,去除上清; 
6) 加入10ml DMEM 培養(yǎng)液(含10%FBS),重新懸浮細(xì)胞,使細(xì)胞充分打散; 
7) 進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),(4 個大方格細(xì)胞數(shù)的均值×104 個為每ml 所含細(xì)胞數(shù)); 
8) 根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果,將適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)接入含有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶 
或皿中;(第二天做轉(zhuǎn)染,A.Fugene6 法--細(xì)胞總量應(yīng)達(dá)4-5×106 /10cm 培養(yǎng) 
皿; B. 磷酸鈣法: 細(xì)胞總量應(yīng)達(dá)3×106 / 10cm 培養(yǎng)皿); 
9) 置于37 ℃ 5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (注意培養(yǎng)箱應(yīng)有足夠的水分)。 
注:以上所使用的胰蛋白酶、培養(yǎng)液等在使用前都置于37℃水浴中預(yù)熱,以減 
小對細(xì)胞的刺激。 
2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 
2.1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染法 
以下針對293T 細(xì)胞、10cm 培養(yǎng)皿 
目前主要使用試劑盒為Roche 公司的FuGENETM6 Transfection Reagent 
1) 轉(zhuǎn)染前24 小時以4-5×106 /10cm 培養(yǎng)皿的細(xì)胞總量鋪板,當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài) 
第三章 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 
18 
良好且貼壁細(xì)胞密度達(dá)到50~80%時即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染; 
2) 在1.5ml 離心管中加入需要共轉(zhuǎn)的2 種質(zhì)粒DNA 各5μg,混勻。 
3) 將50μl FuGENE6 脂質(zhì)體加入500μl DMEM(serum free)培養(yǎng)液(注意不要 
將FuGENE6 脂質(zhì)體沾到管壁),加入前述DNA,輕輕混勻,RT 培養(yǎng)30 分 
鐘; 
4) 將含有DNA 和脂質(zhì)體的液體小心加入到培養(yǎng)皿中,分散均勻,置于37 ℃ 5 
%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48 小時。 
2.2 磷酸鈣介導(dǎo)的貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染法 

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