人磷酯酶C(PLC)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)

1.試劑盒用途

本試劑盒用于體外定量檢測(cè)待測(cè)樣品中重組胰蛋白酶含量。本試劑盒僅供研究和工業(yè)生產(chǎn)使用。

2.試劑盒基本參數(shù)

靈敏度：≤ 1 ng/ml

檢測(cè)范圍：0.078 - 40 ng/ml

特異性：可檢測(cè)重組胰蛋白酶，與其它重組大腸菌表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)蛋白無(wú)明顯交叉反應(yīng)。

重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均 < 10%。

工作時(shí)間：熟練實(shí)驗(yàn)人員可在 2.5 小時(shí)內(nèi)完成一次測(cè)定。

有效期：6 個(gè)月

3.試劑盒組成及保存

未拆封的試劑盒可在 2-8℃保存一周。如果一周以后才使用試劑盒，請(qǐng)拆開(kāi)試劑盒按照下表中的條件分別保存各組分。

人磷酯酶C(PLC)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)說(shuō)明:①所有試劑瓶須旋緊瓶蓋以防止蒸發(fā)和微生物污染。

②酶標(biāo)板-20℃可存放 6 個(gè)月，2-8℃存放勿超過(guò)一周。

4.試驗(yàn)所需自備物品

① 酶標(biāo)儀（濾光片波長(zhǎng) 450 nm 和 650nm）

② 高精度移液器，EP 管及一次性吸頭，加樣槽

37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

④ 潔凈無(wú)紙屑的吸水紙或干布

5.待測(cè)樣品注意事項(xiàng)

①樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于 2-8℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1 個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或 -80℃（3 個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融。②試劑盒檢測(cè)范圍不等同于樣本的濃度范圍，如果樣品中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后再測(cè)。

③.若使用化學(xué)裂解液制備的樣本或細(xì)胞提取液，由于引入某些化學(xué)物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致 ELISA 測(cè)值出現(xiàn)偏差。

6.檢測(cè)前準(zhǔn)備工作

①請(qǐng)?zhí)崆?20 分鐘從冰箱中取出試劑盒平衡至室溫，觀察溶液是否有結(jié)晶，如果有結(jié)晶按提示進(jìn)行操作。提前 15 分鐘打開(kāi)酶標(biāo)儀預(yù)熱。

②稀釋液配制

將濃縮標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液&HRP-抗體稀釋液用雙蒸水稀釋?zhuān)?：25）。

③洗滌液配制

將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋?zhuān)?：25）。

提示：從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象，可用 40℃水浴加熱使結(jié)晶

*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過(guò) 50℃，使用時(shí)洗滌液溫度應(yīng)為室溫）。請(qǐng)當(dāng)日使用。

④標(biāo)準(zhǔn)品配制

將標(biāo)準(zhǔn)品于 1000 轉(zhuǎn)/分離心 1 分鐘后，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 1.0 mL 至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋，靜置 10 分鐘后上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為 10 ng/mL）, 然后進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)ㄗⅲ翰灰苯釉诜磻?yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?。建議配制成以下濃度：10、 5、 2.5、 1.25、 0.63、0.312、0.156、0 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/mL。

提示：溶解和稀釋標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)程中盡量避免產(chǎn)生氣泡。

倍比稀釋方法

7 只 EP 管，每管加入 500 μL 標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液，從 10 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取 500 μL 加入含有 500 μL 標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液的 EP 管中混勻配成 5 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。如下圖。

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋圖例（以 500 μL 為例）

提示：后一管直接作為空白孔，不再加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

⑤HRP-抗體工作液配制

實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先將抗體管 1000 轉(zhuǎn)/分離心 1 分鐘，以避免管壁及管蓋上殘留抗體。計(jì)算實(shí)驗(yàn)所

需抗體用量（以 100 μL /孔計(jì)算），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 100-200 μL 工作液。使用前 15 分鐘，用 HRP-抗體稀釋液將濃縮辣根過(guò)氧化物酶化抗體稀釋為工作濃度（抗體：稀釋液 = 1：250），當(dāng)日使用。

⑥顯色底物（TMB）工作液配制

計(jì)算實(shí)驗(yàn)所需顯色底物用量（以 100 μL /孔計(jì)算），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 100-200 μL 顯色底物工作液。使用前 15 分鐘，用底物稀釋液將 TMB 顯色底物稀釋為工作濃度（底物：稀釋液=1：20），避光保存，當(dāng)日使用。

提示：配制顯色底物（TMB）工作液要嚴(yán)格避免污染，如出現(xiàn)變藍(lán)的現(xiàn)象應(yīng)重新配制。

7.洗板方法

①自動(dòng)洗板機(jī)：每孔加入洗滌液 350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整），注入和吸出間60 秒。②手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無(wú)紙屑的吸水紙或干布上拍干，每孔加入洗滌液 350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整），浸泡 2-3 分鐘，甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無(wú)紙屑的吸水紙上拍干。

8.操作步驟

①將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中，每個(gè)濃度的工作液并列加兩孔（復(fù)孔），每孔1μL。待測(cè)樣品加入到其他孔，每孔 100 μL，若樣本濃度高于檢測(cè)范圍，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后加樣。將酶標(biāo)板覆膜并置于 37℃孵育 60 分鐘。

提示：加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板混勻避免產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)間控制在 10 分鐘內(nèi)。

②洗滌：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無(wú)紙屑的吸水紙或干布上拍干。每孔加入 350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整）洗滌液，浸泡 2-3 分鐘，甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無(wú)紙屑的吸水紙或干布上拍干。重復(fù)此洗板步驟 3 次。

③每孔加入 HRP-抗體工作液 100 μL，輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板混勻避免產(chǎn)生氣泡，將酶標(biāo)板覆膜并置于 37℃孵育 30 分鐘。

④洗滌：用洗滌液洗板 4 次，方法同步驟 2。

提示：酶標(biāo)板洗滌不*可能會(huì)造成標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度差，或背景值高。應(yīng)注意加入洗滌液的體積，以加滿酶標(biāo)板的孔為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整，確保所有的孔浸泡在洗滌液中并浸泡 2-3 分鐘。⑤顯色：每孔加顯色底物（TMB）工作液 100 μL，酶標(biāo)板覆膜置于 37℃ 孵育 10 分鐘。

提示: 加顯色底物推薦使用排槍和加樣槽，但應(yīng)嚴(yán)格避免底物污染，確保所使用的加樣槽潔凈或一次性使用，加液時(shí)移液槍的槍頭切不要接觸孔內(nèi)溶液以避免污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？赏ㄟ^(guò)觀察加樣槽中底物是否變藍(lán)預(yù)判底物是否被污染。根據(jù)實(shí)際顯se情況酌情縮短或延長(zhǎng)，顯色時(shí)間在 5-30 分鐘范圍內(nèi)。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止。

⑥終止：每孔加終止液 50 μL，終止反應(yīng)，室溫放置 1 分鐘。推薦使用排槍和加樣槽。

提示: 終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。加液時(shí)移液槍的槍頭切不要接觸孔內(nèi)溶液以避免污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

⑦讀數(shù)：用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)（參考波長(zhǎng) 650nm）測(cè)量各孔的光密度（OD450/650 nm 值）。

提示: 請(qǐng)?zhí)崆?15 分鐘打開(kāi)酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置檢測(cè)程序。

9.結(jié)果判斷

①計(jì)算每組復(fù)孔的平均 OD 值。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的平均 OD 值減去空白孔的 OD 值作為矯正值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（X），OD 值為縱坐標(biāo)（Y），繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（作圖時(shí)亦可去掉空白組的值）。

②推薦使用專(zhuān)業(yè)的曲線制作軟件，如 curve expert 1.3 或 ELISA Calc（請(qǐng)使用 Logistic 五參數(shù)擬合曲線計(jì)算方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）等。

③若樣品 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)。

④典型數(shù)據(jù)

由于實(shí)驗(yàn)操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和穩(wěn)定條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的 OD 值會(huì)有所差異。以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

10.注意事項(xiàng)

①儲(chǔ)存：試劑盒中各種試劑請(qǐng)按說(shuō)明書(shū)提示合理存放。儲(chǔ)存及溫育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶需旋緊以防止蒸發(fā)和微生物污染，否則可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果。

②酶標(biāo)板：剛開(kāi)啟的酶標(biāo)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。暫時(shí)不用板條應(yīng)拆下后放入備用自封袋，按推薦溫度存放。

③加樣：加樣和加同一試劑時(shí)，第yi孔與后孔之間加樣時(shí)間間隔過(guò)大將導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯的影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性，每次的加樣時(shí)間控制在 10 分鐘之內(nèi)，推薦設(shè)置復(fù)孔。

④溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須給酶標(biāo)板覆膜，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)。嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

⑤洗板：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙或干布上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。讀數(shù)前要清除酶標(biāo)板底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。

⑥試劑配制：試劑盒在運(yùn)輸過(guò)程中會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用 1000 轉(zhuǎn)/分離心一分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前請(qǐng)用移液器小心吹打 4-5 次使溶液混勻。所有試劑請(qǐng)按說(shuō)明書(shū)指示請(qǐng)配制。

⑦顯色時(shí)間的控制：加入底物后，請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔五分鐘），如梯度已經(jīng)很明顯，請(qǐng)?zhí)崆凹咏K止液終止反應(yīng)，以避免顏色過(guò)深，影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。

⑧底物：請(qǐng)避光保存底物。在儲(chǔ)存和溫育時(shí)，避免強(qiáng)光直接照射。

⑨混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器，使用低頻率，如無(wú)微量振蕩器，可以在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。

提示：不同批號(hào)的試劑盒組分不能混用（洗滌液和終止液除外）。

⑩關(guān)于樣品回收率

1）本試劑盒以測(cè)定重組豬胰蛋白酶的抗原性而非活力來(lái)推測(cè)殘留量，因此試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品采用胰蛋白酶的消光系數(shù)（E1%1cm=13.6D, 即當(dāng) A280nm=1.36 時(shí)，胰蛋白酶濃度為 1mg/ml）來(lái)計(jì)算其蛋白含量，以大限度保持質(zhì)控的和穩(wěn)定性。

2）不同計(jì)量方法以及產(chǎn)品純度的差別可以導(dǎo)致不同來(lái)源、不同批次產(chǎn)品中胰蛋白酶的蛋白含量不*一致，也會(huì)造成回收率的差異。

3）為避免上述因素影響，建議將用作回收率測(cè)試的樣品采用分光光度法（A280nm）估算蛋白含量，再稀釋至適合的濃度用于回收率測(cè)試，盡量減少回收率的誤差。

11.問(wèn)題分析

若實(shí)驗(yàn)結(jié)果有問(wèn)題，請(qǐng)及時(shí)對(duì)顯色結(jié)果拍照，并妥善保存未使用板條及試劑，然后聯(lián)系技術(shù)支持。也可參考以下信息以找出原因。