人6-羥多巴胺(6-OHDA)ELISA試劑盒

使用說明書

（96T）

使用前請仔細閱讀說明書和提示部分。若有任何問題，請聯(lián)系我們。

1.試劑盒用途

本試劑盒用于體外定量檢測待測樣品中重組胰蛋白酶含量。本試劑盒僅供研究和工業(yè)生產(chǎn)使用。

2.試劑盒基本參數(shù)

靈敏度：≤ 1 ng/ml

檢測范圍：0.078 - 40 ng/ml

特異性：可檢測重組胰蛋白酶，與其它重組大腸菌表達系統(tǒng)相關蛋白無明顯交叉反應。

重復性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均 < 10%。

工作時間：熟練實驗人員可在 2.5 小時內(nèi)完成一次測定。

有效期：6 個月

3.試劑盒組成及保存

未拆封的試劑盒可在 2-8℃保存一周。如果一周以后才使用試劑盒，請拆開試劑盒按照下表中的條件分別保存各組分。

說明:

①所有試劑瓶須旋緊瓶蓋以防止蒸發(fā)和微生物污染。

②酶標板-20℃可存放 6 個月，2-8℃存放勿超過一周。

4.試驗所需自備物品

① 酶標儀（濾光片波長 450 nm 和 650nm）

② 高精度移液器，EP 管及一次性吸頭，加樣槽

• 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

④ 潔凈無紙屑的吸水紙或干布

5.待測樣品注意事項

①樣品收集后若在 1 周內(nèi)進行檢測的可保存于 2-8℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1 個月內(nèi)檢測），或 -80℃（3 個月內(nèi)檢測），避免反復凍融。②試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍，如果樣品中檢測物濃度高于標準品zui高值，請根據(jù)實際情況，做適當倍數(shù)稀釋后再測。

③.若使用化學裂解液制備的樣本或細胞提取液，由于引入某些化學物質(zhì)會導致 ELISA 測值出現(xiàn)偏差。

6.檢測前準備工作

①請?zhí)崆?20 分鐘從冰箱中取出試劑盒平衡至室溫，觀察溶液是否有結(jié)晶，如果有結(jié)晶按提示進行操作。提前 15 分鐘打開酶標儀預熱。

②稀釋液配制

將濃縮標準品&樣品稀釋液&HRP-抗體稀釋液用雙蒸水稀釋（1：25）。

③洗滌液配制

將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋（1：25）。

提示：從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象，可用 40℃水浴加熱使結(jié)晶

*溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過 50℃，使用時洗滌液溫度應為室溫）。請當

日使用。

④標準品配制

將標準品于 1000 轉(zhuǎn)/分離心 1 分鐘后，加入標準品&樣品稀釋液 1.0 mL 至凍干標準品中，旋緊管蓋，靜置 10 分鐘后上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為 10 ng/mL）, 然后進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以

下濃度：10、 5、 2.5、 1.25、 0.63、0.312、0.156、0 ng/mL。標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/mL。

提示：溶解和稀釋標準品過程中盡量避免產(chǎn)生氣泡。

倍比稀釋方法

• 7 只 EP 管，每管加入 500 μL 標準品&樣品稀釋液，從 10 ng/mL 的標準品工作液中吸取 500 μL 加入含有 500 μL 標準品&樣品稀釋液的 EP 管中混勻配成 5 ng/mL 的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。如下圖。

標準品稀釋圖例（以 500 μL 為例）

提示：后一管直接作為空白孔，不再加入標準品工作液。

⑤HRP-抗體工作液配制

實驗前請先將抗體管 1000 轉(zhuǎn)/分離心 1 分鐘，以避免管壁及管蓋上殘留抗體。計算實驗所

需抗體用量（以 100 μL /孔計算），實際配制時應多配制 100-200 μL 工作液。使用前 15 分

鐘，用 HRP-抗體稀釋液將濃縮辣根過氧化物酶化抗體稀釋為工作濃度（抗體：稀釋液 = 1：

250），當日使用。

⑥顯色底物（TMB）工作液配制

計算實驗所需顯色底物用量（以 100 μL /孔計算），實際配制時應多配制 100-200 μL 顯色底物工作液。使用前 15 分鐘，用底物稀釋液將 TMB 顯色底物稀釋為工作濃度（底物：稀釋液=1：20），避光保存，當日使用。

提示：配制顯色底物（TMB）工作液要嚴格避免污染，如出現(xiàn)變藍的現(xiàn)象應重新配制。

7.洗板方法

①自動洗板機：每孔加入洗滌液 350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標準進行調(diào)整），注入和吸出間

• 60 秒。②手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干，每孔加入洗滌液 350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標準進行調(diào)整），浸泡 2-3 分鐘，甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙上拍干。

8.操作步驟

①將標準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔（復孔），每孔

1. μL。待測樣品加入到其他孔，每孔 100 μL，若樣本濃度高于檢測范圍，需用標準品&樣本稀釋液稀釋后加樣。將酶標板覆膜并置于 37℃孵育 60 分鐘。

提示：加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動酶標板混勻避免產(chǎn)生氣泡。

加樣時間控制在 10 分鐘內(nèi)。

②洗滌：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干。每孔加入 350-400 μL（根據(jù)加滿孔的標準進行調(diào)整）洗滌液，浸泡 2-3 分鐘，甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈無紙屑的吸水紙或干布上拍干。重復此洗板步驟 3 次。

③每孔加入 HRP-抗體工作液 100 μL，輕輕晃動酶標板混勻避免產(chǎn)生氣泡，將酶標板覆膜并置于 37℃孵育 30 分鐘。

④洗滌：用洗滌液洗板 4 次，方法同步驟 2。

提示：酶標板洗滌不*可能會造成標準曲線梯度差，或背景值高。應注意加入洗滌液的體

積，以加滿酶標板的孔為標準進行調(diào)整，確保所有的孔浸泡在洗滌液中并浸泡 2-3 分鐘。⑤顯色：每孔加顯色底物（TMB）工作液 100 μL，酶標板覆膜置于 37℃ 孵育 10 分鐘。

提示: 加顯色底物推薦使用排槍和加樣槽，但應嚴格避免底物污染，確保所使用的加樣槽潔凈或一次性使用，加液時移液槍的槍頭切不要接觸孔內(nèi)溶液以避免污染，影響實驗結(jié)果?？赏ㄟ^觀察加樣槽中底物是否變藍預判底物是否被污染。根據(jù)實際顯se情況酌情縮短或延長，顯色時間在 5-30 分鐘范圍內(nèi)。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止。

⑥終止：每孔加終止液 50 μL，終止反應，室溫放置 1 分鐘。推薦使用排槍和加樣槽。

提示: 終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。加液時移液槍的槍頭切不要接觸孔內(nèi)溶液以避免污染，影響實驗結(jié)果。

⑦讀數(shù)：用酶標儀在 450 nm 波長（參考波長 650nm）測量各孔的光密度（OD450/650 nm 值）。

提示: 請?zhí)崆?15 分鐘打開酶標儀電源，預熱儀器，設置檢測程序。

9.結(jié)果判斷

①計算每組復孔的平均 OD 值。每個標準品的平均 OD 值減去空白孔的 OD 值作為矯正值。以標準品的濃度為橫坐標（X），OD 值為縱坐標（Y），繪出標準曲線（作圖時亦可去掉空白組的值）。

②推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如 curve expert 1.3 或 ELISA Calc（請使用 Logistic 五參數(shù)擬合曲線計算方法繪制標準曲線）等。

③若樣品 OD 值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測。

④典型數(shù)據(jù)

由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和穩(wěn)定條件等），標準曲線的 OD 值會有所差異。以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標準曲線。

10.注意事項

①儲存：試劑盒中各種試劑請按說明書提示合理存放。儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶需旋緊以防止蒸發(fā)和微生物污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤結(jié)果。

②酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。暫時不用板條應拆下后放入備用自封袋，按推薦溫度存放。

③加樣：加樣和加同一試劑時，di一孔與后孔之間加樣時間間隔過大將導致不同的“預溫育”時間，從而明顯的影響到測量值的準確性及重復性，每次的加樣時間控制在 10 分鐘之內(nèi)，推薦設置復孔。

④溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標板覆膜，洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板處于干燥狀態(tài)。嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

⑤洗板：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙或干布上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。讀數(shù)前要清除酶標板底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數(shù)。

⑥試劑配制：試劑盒在運輸過程中會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用 1000 轉(zhuǎn)/分離心一分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前請用移液器小心吹打 4-5 次使溶液混勻。所有試劑請按說明書指示請配制。

⑦顯色時間的控制：加入底物后，請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔五分鐘），如梯度已經(jīng)很明顯，請?zhí)崆凹咏K止液終止反應，以避免顏色過深，影響酶標儀讀數(shù)。

⑧底物：請避光保存底物。在儲存和溫育時，避免強光直接照射。

⑨混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻Y(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器，使用低頻率，如無微量振蕩器，可以在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

提示：不同批號的試劑盒組分不能混用（洗滌液和終止液除外）。

⑩關于樣品回收率

1）本試劑盒以測定重組豬胰蛋白酶的抗原性而非活力來推測殘留量，因此試劑盒中標準品采用胰蛋白酶的消光系數(shù)（E1%1cm=13.6D, 即當 A280nm=1.36 時，胰蛋白酶濃度為 1mg/ml）來計算其蛋白含量，以大限度保持質(zhì)控的和穩(wěn)定性。

2）不同計量方法以及產(chǎn)品純度的差別可以導致不同來源、不同批次產(chǎn)品中胰蛋白酶的蛋白含量不*一致，也會造成回收率的差異。

3）為避免上述因素影響，建議將用作回收率測試的樣品采用分光光度法（A280nm）估算蛋白含量，再稀釋至適合的濃度用于回收率測試，盡量減少回收率的誤差。

11.問題分析

若實驗結(jié)果有問題，請及時對顯色結(jié)果拍照，并妥善保存未使用板條及試劑，然后聯(lián)系技術(shù)支持。也可參考以下信息以找出原因。