液相色譜分類及基礎(chǔ)原理

液相色譜是一類分離與分析，其特點是以液體作為流動相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。在色譜發(fā)展的過程中。為了區(qū)分多種方法，根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名，如紙色譜、薄層色譜和柱液相色經(jīng)典液相色譜的流動相是依靠重力緩慢地流過色譜柱，因此固定相的粒度不可能太?。?00μm～150μm左右）。分離后的樣品是被分級收集后再進行分析的，使得經(jīng)典液相色譜分離效率低、分析速度慢，而且操作也比較復(fù)雜。直到20世紀60年代。發(fā)展出粒度小于10μm的固定相，并使用了高壓輸液泵和自動記錄的檢測器，克服了經(jīng)典液相色譜的缺點，發(fā)展成液相色譜，也稱為高壓液相色譜。



液相色譜按其分離機理，可分為四種類型。




一、吸附色譜法

吸附色譜法的固定相為吸附劑，色譜的分離過程是在吸附劑表面進行的，不進入固定相的內(nèi)。與氣相色譜不同，流動相（即溶劑）分子也與吸附劑表面發(fā)生吸附作用。在吸附劑表面，樣品分子與流動相分子進行吸附競爭，因此流動相的選擇對分離效果有很大的影響，一般可采用梯度淋洗法來提色譜分離效率。



在聚合物的分析中，吸附色譜一般用來分離添加劑，如偶氮染料、抗氧化劑、表面活性劑等，也可用于石油烴類的組成分析。





二、分配色譜法

這種色譜的流動相和固定相都是液體，樣品分子在兩個液相之間很快達到平衡分配，利用各組分在兩相中分配系數(shù)的差異進行分離，類似于萃取過程。



一般常用的固定液有β,β\'-氧二（ODPN）和角鯊?fù)椋⊿Q）。采用與氣相色譜（GC）同樣的方法，將固定液涂漬在多孔的載體表面，但在使用中固定液易流失。目前，應(yīng)用較多的是鍵合固定相。在這種固體相中，固定液不是涂在載體表面，而是通過化學(xué)反應(yīng)在純硅膠顆粒表面鍵合上某種有機基團。



例如，利用氯代十八烷基硅烷與硅膠表面的羥基（-OH）之間的反應(yīng)就可以形成一烷基化表面。這種固定液的優(yōu)點是不易被流動相剝蝕。在分配色譜法中，流動相可為純?nèi)軇部梢圆捎没旌先軇┻M行梯度淋洗，其極性應(yīng)與固定液差別大一些，以防兩者之間相溶。通常可分為正相分配和反相分配。





三、離子交換色譜

離子交換色譜通常用離子交換樹脂作為固定相。一般是樣品離子與固定相離子進行可逆交換，由于各組分離子的交換能力不同，從而達到色譜的分離。



離子交換色譜法是新發(fā)展起來的一項現(xiàn)代分析技術(shù)，已大范圍用于氨基酸、蛋白質(zhì)的分析，也適合于某些無機離子（NO3-、SO42-、Cl-等無機陰離子和Na+、Ca2+、Mg2+、K+等無機陽離子）的分離和分析，具有重要的作用。





四、凝膠色譜法

目前，凝膠色譜法既適用于水溶液的體系，又適用于有機溶劑的體系。當所用的洗脫劑為水溶液時，稱為凝膠過濾色譜，其在生物界的應(yīng)用比較多；采用有機溶劑為洗脫劑時，稱為凝膠滲透色譜，在高分子領(lǐng)域應(yīng)用較多。







基本原理

使用液相色譜時，液體待檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由于被測物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，后通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質(zhì)。液相色譜作為一種重要的分析方法，應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別，它的特點是采用了高壓輸液泵、高敏度檢測器和微粒固定相，適于分析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。





什么是液相色譜法（HPLC）?

縮寫 HPLC，引自 Csaba Horváth 教授之后在 1970 年匹茨堡大會上的文章，原指在填料柱中產(chǎn)生所需的流速需要高壓。早期的泵只能承受500 psi （35bar）。這就被稱為高壓液相色譜法（HPLC）七十年代早期取得大進步。新型的高壓液相色譜儀器可以承受 6000psi（400 bar）的壓力，還能配上改進的進樣器，檢測器和色譜柱。高壓液相色譜法確實開始成為二十世紀七十年代中晚期的普遍分析方法。隨著這一期間不斷的性能改進（小顆粒，高壓力），字母縮寫保持一樣，但全稱變?yōu)椋╤igh-performance） 液相色譜（HPLC）。液相色譜（HPLC）是目前分析化學(xué)的工具之一。它能夠分離、定性和定量任何可以溶解在液體中的化合物。今天，痕量化合物甚至低至千萬分之一也可。



一個儲液瓶裝有溶劑（稱為流動相，因為溶劑是流動的）。一個高壓泵（溶劑傳輸系統(tǒng)或稱溶劑管理器）用來產(chǎn)生和計量流動相的流速，一般是毫升/分鐘。一個進樣器（樣品管理器或自動進樣器）可以將樣品導(dǎo)入（注射）連續(xù)的流動相，并由流動相攜帶樣品進入液相色譜柱。色譜柱裝有能獲得分離效果的填料。這種填料稱為固定相因為它被柱硬件包圍住。檢測器用來查看化合物流出色譜柱時被分開的譜帶（大多數(shù)化合物沒有顏色，所以人眼觀察不到）。流動相流出檢測器可被送至廢液瓶，或按需被收集。當流動相含有一個分開的化合物譜帶，液相色譜可以收集含有純化的化合物的該洗脫組分，用于進一步分析。這種方法稱為制備液相（在液相色譜量級中討論）。注意高壓管路和附件用來連接泵、進樣器、色譜柱和檢測器單元，形成流動相、樣品和化合物分離譜帶的通路。



檢測器連接計算機數(shù)據(jù)站，液相色譜系統(tǒng)單元先記錄電信號，再將電信號轉(zhuǎn)換為色譜圖，在顯示屏上展現(xiàn)出來。定性和定量樣品內(nèi)溶物濃度。由于樣品中化合物性質(zhì)差異很大，幾種類型的檢測器被開發(fā)出來。例如，如果一個化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收檢測器。如果這個化合物發(fā)熒光，可使用熒光檢測器。如果該化合物沒有上述性質(zhì)之一，可使用的檢測器，如蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）。方式是順序使用多個檢測器。例如，紫外和/或蒸發(fā)光檢測器可和質(zhì)譜儀（MS）聯(lián)用來分析色譜分離的組分。這樣，從一次進樣，可得到分析物的多綜合的信息。將質(zhì)譜與液相色譜系統(tǒng)耦合稱之為液質(zhì)聯(lián)用。