近期，我們介紹了 Leica SP8 FALCON 的一些應用案例，它能實時測量分子間的相互作用 (FLIM-FRET)，實時測量鈣濃度變化，實時測量熒光分子的代謝 (如癌變引起的 NADH 的壽命變化) 或者所處微環(huán)境的變化 (如 pH)，能對光譜相近的不同染料或自發(fā)熒光和染料進行拆分，還能與共聚焦的多種采圖模式 (如智能化大圖拼接、光譜掃描、時間序列、三維層切) 和技術 (如 DIVE 多光子成像、STED 納米分辨率成像) 相結(jié)合?？傊?， FALCON 是熒光功能成像的極jia工具。

那么今天咱們就講講 FALCON 的使用技巧，幫助大家更好地理解這個新技術。

熒光壽命測量步驟

SP8 FALCON 的熒光壽命成像 (FLIM) 功能內(nèi)置在共聚焦操作軟件 LAS X 里，只需點擊 FLIM 即可激活 (見下圖)。

接下來，我們只需三步就可以完成熒光壽命測量。本文中所用樣品為雛菊 (Bellis Perennis) 花蕾。

1. 預覽及調(diào)節(jié)參數(shù)

點擊預覽，系統(tǒng)同時顯示熒光強度圖、平均熒光壽命圖和平均熒光壽命曲線，并以光子數(shù)直方圖中的紅線來提示光子數(shù)的理想上限 (見下圖)，便于我們調(diào)節(jié)激光強度獲得理想的光子數(shù) (以接近但不超過紅線為宜)。

2. 設置條件并采圖

在采集時間、采集幀數(shù)及大光子數(shù)三者中選擇設置一項即可 (見下圖)，如果需要采集時間序列或者三維，按常規(guī)共聚焦采集模式設置總時長或?qū)忧衅瘘c/終點即可。然后點擊 start 進行采圖。

3. 數(shù)據(jù)分析

選擇壽命成分數(shù)量 (見下圖一棕色箭頭)，點擊 Fit (圖一紅色箭頭)，系統(tǒng)即自動進行曲線擬合。壽命成分數(shù)量可從 1 開始，直至獲得滿意的擬合曲線 (見圖三)。同時，系統(tǒng)根據(jù)擬合結(jié)果顯示熒光壽命圖 （見圖二）。

到這里，圖像和數(shù)據(jù)的采集及分析就完成了，點擊保存圖像和結(jié)果即可。

一鍵采圖，一鍵擬合，so easy！

壽命成分拆分圖像

當然，我們還可以根據(jù)擬合出的壽命成分對圖像進行拆分，以上述分析結(jié)果為例，點擊 FLIM Image Fit，系統(tǒng)自動按照擬合出的三種壽命進行拆分，得到以下圖像。這特別適合于拆分光譜接近的不同染料或者染料和自發(fā)熒光。以后遇到多色熒光成像，再也不用擔心串色和分不開了。

對厚樣品，F(xiàn)ALCON 還可以直接采集和顯示三維的熒光壽命圖像 (見下圖)，要做成視頻也*沒有問題，用 LAS X 的 3D 重建模塊就可以。

SP8 FALCON 的功能還遠不止于此，它還能進行任意感興趣區(qū)域分析、FRET 分析、Pattern Match 分析，和 DIVE、STED 結(jié)合成像，以及近期剛剛增加的 Phasor 功能，為傳統(tǒng)的熒光成像增加維度、拓寬思路。有興趣的話，且聽下回分解。