近期,我們介紹了 Leica SP8 FALCON 的一些應用案例,它能實時測量分子間的相互作用 (FLIM-FRET),實時測量鈣濃度變化,實時測量熒光分子的代謝 (如癌變引起的 NADH 的壽命變化) 或者所處微環(huán)境的變化 (如 pH),能對光譜相近的不同染料或自發(fā)熒光和染料進行拆分,還能與共聚焦的多種采圖模式 (如智能化大圖拼接、光譜掃描、時間序列、三維層切) 和技術 (如 DIVE 多光子成像、STED 納米分辨率成像) 相結(jié)合??傊?, FALCON 是熒光功能成像的極jia工具。
那么今天咱們就講講 FALCON 的使用技巧,幫助大家更好地理解這個新技術。
熒光壽命測量步驟
SP8 FALCON 的熒光壽命成像 (FLIM) 功能內(nèi)置在共聚焦操作軟件 LAS X 里,只需點擊 FLIM 即可激活 (見下圖)。
接下來,我們只需三步就可以完成熒光壽命測量。本文中所用樣品為雛菊 (Bellis Perennis) 花蕾。
1. 預覽及調(diào)節(jié)參數(shù)
點擊預覽,系統(tǒng)同時顯示熒光強度圖、平均熒光壽命圖和平均熒光壽命曲線,并以光子數(shù)直方圖中的紅線來提示光子數(shù)的理想上限 (見下圖),便于我們調(diào)節(jié)激光強度獲得理想的光子數(shù) (以接近但不超過紅線為宜)。
2. 設置條件并采圖
在采集時間、采集幀數(shù)及大光子數(shù)三者中選擇設置一項即可 (見下圖),如果需要采集時間序列或者三維,按常規(guī)共聚焦采集模式設置總時長或?qū)忧衅瘘c/終點即可。然后點擊 start 進行采圖。
3. 數(shù)據(jù)分析
選擇壽命成分數(shù)量 (見下圖一棕色箭頭),點擊 Fit (圖一紅色箭頭),系統(tǒng)即自動進行曲線擬合。壽命成分數(shù)量可從 1 開始,直至獲得滿意的擬合曲線 (見圖三)。同時,系統(tǒng)根據(jù)擬合結(jié)果顯示熒光壽命圖 (見圖二)。
到這里,圖像和數(shù)據(jù)的采集及分析就完成了,點擊保存圖像和結(jié)果即可。
一鍵采圖,一鍵擬合,so easy!
壽命成分拆分圖像
當然,我們還可以根據(jù)擬合出的壽命成分對圖像進行拆分,以上述分析結(jié)果為例,點擊 FLIM Image Fit,系統(tǒng)自動按照擬合出的三種壽命進行拆分,得到以下圖像。這特別適合于拆分光譜接近的不同染料或者染料和自發(fā)熒光。以后遇到多色熒光成像,再也不用擔心串色和分不開了。
對厚樣品,F(xiàn)ALCON 還可以直接采集和顯示三維的熒光壽命圖像 (見下圖),要做成視頻也*沒有問題,用 LAS X 的 3D 重建模塊就可以。
SP8 FALCON 的功能還遠不止于此,它還能進行任意感興趣區(qū)域分析、FRET 分析、Pattern Match 分析,和 DIVE、STED 結(jié)合成像,以及近期剛剛增加的 Phasor 功能,為傳統(tǒng)的熒光成像增加維度、拓寬思路。有興趣的話,且聽下回分解。
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