人纖維母細(xì)胞表面抗原(FSP)ELISA試劑盒相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究：

CCL21/CCR7信號(hào)途徑與移植腎纖維化關(guān)系的研究
摘要：通過免疫組織化學(xué)和免疫熒光雙重染色的方法,觀察CCL21和CCR7在移植腎穿刺活檢組織中的表達(dá)情況,同時(shí)觀察纖維母細(xì)胞的標(biāo)記物FSP和S100A4在移植腎穿刺組織中的分布,選擇纖維母細(xì)胞的*標(biāo)示物,此外,結(jié)合臨床資料分析腎移植病人臨床預(yù)后與FSP、CCL21和CCR7表達(dá)的關(guān)系,初步探索纖維母細(xì)胞和CCL21/CCR7信號(hào)通路與移植腎纖維化的關(guān)系。方法:收集吉林大學(xué)腎移植中心現(xiàn)有的腎臟穿刺標(biāo)本78例,常規(guī)HE染色、PAS染色和MASSOM染色后進(jìn)行病理診斷,而后對(duì)各階段移植腎穿刺活檢病例進(jìn)行纖維母細(xì)胞表面抗原FSP,纖維母細(xì)胞特異抗原S100A4,趨化因子CCL21和其受體CCR7的免疫組織化學(xué)染色,觀察各抗體的分布及表達(dá);再利用CCL21分別和FSP、CCR7進(jìn)行免疫熒光雙重染色,在共聚焦顯微鏡下觀察定位它們的表達(dá)情況,探討CCL21/CCR7信號(hào)通路與移植腎纖維化的關(guān)系,并結(jié)合臨床資料分析纖維母細(xì)胞和CCL21/CCR7信號(hào)通路與病人的臨床發(fā)展聯(lián)系。結(jié)果:FSP、S100A4、CCR7、CCL21均在移植腎活檢組織中存在陽(yáng)性表達(dá)。
試劑盒的組成： 
（1）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；
（2）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；
（3）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；
（4）酶的底物；
（5）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），elisa試劑盒參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）；
（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）
用途：科研與實(shí)驗(yàn)試劑，不得用于臨床診斷。
檢測(cè)種屬：人、大小鼠、兔、羊、猴、豬、豚鼠ELISA檢測(cè)試劑盒等種屬。
標(biāo)本：血清、血漿、細(xì)胞上清液、尿液、體液、灌洗液、腦脊髓、心房水、胸房水、組織等。 

人纖維母細(xì)胞表面抗原(FSP)ELISA試劑盒雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體含量。

液體類標(biāo)本：
包括血清，血漿，尿液，胸腹水，腦脊液，細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中如有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，在離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
尿液：
用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右，通過反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并釋放細(xì)胞內(nèi)的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后，稱取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆茫瑯?biāo)本融化后仍保持2-8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，分裝后留一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

 ELISA試劑盒代理，臨床ELISA測(cè)定中可能會(huì)出現(xiàn)的問題及可能的原因
問 題 可能的原因（非試劑盒本身的原因）
1．弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本檢測(cè)不出 溫育的時(shí)間或溫度不夠；顯色反應(yīng)時(shí)間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問題
2．測(cè)定的重復(fù)性差 （相同樣本兩次測(cè)定結(jié)果不一致） 這是典型的由測(cè)定操作引起的問題，包括
（1）加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；
（2）加樣過快，孔間發(fā)生污染；
（3）加錯(cuò)樣本；
（4）加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū)；
（5）不同批號(hào)試劑盒中組分混用；
（6）溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致；
（7）孔內(nèi)污染雜物；
（8）酶標(biāo)儀濾光片不正確；
（9）血清標(biāo)本未*凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)等。
3．白板
（陽(yáng)性對(duì)照不顯色） （1）漏加酶結(jié)合物；
（2）洗板液配制中出現(xiàn)問題，如量筒不干凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等。
（3）漏加顯色劑A或B；
（4）終止劑當(dāng)顯色劑使用。
4．全部板孔均有顯色 （1）洗板不干凈；
（2）顯色液變質(zhì)；
（3）加底物的吸光受酶污染；
（4）洗板液受酶等污染。 

ELISA試劑盒的包被條件與封閉：包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。 
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時(shí)，因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測(cè)定中，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。