MG1655感受態(tài)細(xì)胞-大腸桿菌類克隆細(xì)胞

MG1655 Chemically Competent Cell 產(chǎn)品說明書

MG1655：                                                    100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                   10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                            -80℃（6個月）

MG1655感受態(tài)細(xì)胞基因型

K12 F- lambda- ilvG- rfb-50 rph-1

MG1655感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品說明

MG1655菌株來源于W1485，是K12的衍生菌株，是一種經(jīng)過較少改造，比較接近于“WT-野生型”的大腸桿菌工程菌株。MG1655外觀形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，同時可做為擴(kuò)增大腸桿菌WT型基因的模板使用，也可作為蛋白表達(dá)的宿主菌株使用，但不含核酸酶endA1突變，體內(nèi)核酸酶含量較高，提取質(zhì)粒時務(wù)必使用質(zhì)粒提取試劑盒中去蛋白液盡量去除核酸酶，以防提取的質(zhì)粒被降解。pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>0.5×10⁸ cfu/μg DNA。

MG1655感受態(tài)細(xì)胞操作方法

1. MG1655感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手撥EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心1分鐘收集菌體，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。如果進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，將平板放37℃培養(yǎng)至少15 h。

注意事項

1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蚵实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。

同一批感受態(tài)細(xì)胞，用含目的片段的T載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（陽性對照）能長出密密麻麻的菌落，而用另一種載體和目的片段的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，卻一個菌都沒長出來，重復(fù)了三次都這樣。請問這是感受態(tài)細(xì)胞的制作不過關(guān)，還是連接出了問題？哪個可能性大些？

答：應(yīng)該是連接的問題。所有連接反應(yīng)建議同時轉(zhuǎn)化酶切后的質(zhì)粒作為另一個陰性對照，確定酶切是否*。同時連接前請確定質(zhì)粒和片段濃度達(dá)到小連接量的要求。

感受態(tài)細(xì)胞放到-80冰箱了有半年了，還能用來轉(zhuǎn)化質(zhì)粒嗎？

答：如-80冰箱儲存過程中沒有發(fā)生凍融的情況，是可以用來轉(zhuǎn)化的，但是由于凍存時間過長，轉(zhuǎn)化效率會有所下降，如果用于普通的質(zhì)粒重轉(zhuǎn)或TA克隆等連接體系也是可以的，如珍貴的樣品請選用較為新鮮的感受態(tài)細(xì)胞。

MG1655 感受態(tài)細(xì)胞說明書的應(yīng)用：

1、細(xì)胞因子檢查試劑盒，如白介素、腫瘤壞死因子、干擾素、轉(zhuǎn)化生長因子、凋亡因子等等； 

2、心肌梗塞檢查ELISA試劑盒，如肌鈣蛋白、肌紅蛋白、C-反響蛋白等等；

3、內(nèi)分泌檢查ELISA試劑盒，如甲狀腺、胰腺、性激素、孕酮、睪酮、生長激素、生長抑素、催乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素等等；

4、肝纖維化檢查ELISA試劑盒，如纖維連接蛋白、膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶，層粘蛋白等等；5、本身免疫檢查，如甲狀腺、抗核抗體、DNA、抗胰島細(xì)胞抗體、蛋白酶、角蛋白抗體、抗核糖體蛋白抗體、抗聚角蛋白微絲蛋白抗體、抗平滑肌抗體等等。