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過氧化氫酶(Catalase,CAT)試劑盒說明書

來源:上海研謹(jǐn)生物科技有限公司   2019年12月06日 18:37  

過氧化氫酶(Catalase,CAT)試劑盒說明書

紫外分光光度法

測定意義:                           

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

測定原理:

H2O2在240nm下有特征吸收峰,CAT能夠分解H2O2,使反應(yīng)溶液240nm下的吸光度隨反應(yīng)時間而下降,根據(jù)吸光度的變化率可計算出CAT活性。

自備的儀器和用品

紫外分光光度計、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰蒸餾水

試劑組成和配制

提取液:60mL×1瓶,4℃保存;

試劑一:60mL×1瓶,4℃保存

試劑二:100uL×3瓶,4℃保存。

粗酶液提取

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g:提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至240nm處,蒸餾水調(diào)零。

2、CAT檢測工作液的配制:用時在每瓶試劑二(100 uL)中加入20mL試劑一,充分混勻,作為工作液;用不完的試劑4℃保存一周;

3、測定前將CAT檢測工作液37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min。

4、取1mLCAT檢測工作液于1mL石英比色皿中,再加入35μL樣本,混勻室溫下立即測定240nm下的初始吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2,計算ΔA=A1-A2

CAT活性計算:

1、血清(漿)CAT活力的計算:

單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/mL)= [ΔA×V反總÷ε×d)×109]÷V樣÷T=678×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計算:

(1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=678×ΔA÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d)×109(W× V樣÷V樣總)÷T=678×ΔA÷W

(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol H2O2降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T =1.356×ΔA

 

V反總:反應(yīng)體系總體積,1.035×10-3 L;ε:H2O2摩爾消光系數(shù),4.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.035 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1 min;W:樣質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。

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