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qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中BCL基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)報(bào)告書范本

來(lái)源:上海創(chuàng)凌生物科技有限公司   2019年12月09日 09:04  

一、 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

 表格一:實(shí)驗(yàn)儀器

儀器名稱

型號(hào)

生產(chǎn)廠家

低溫高速離心機(jī)

64R

BECKMAN  

PCR 儀

9700

ABI

熒光定量 PCR 儀

7500

ABI

 

儀器

廠家

型號(hào)

小型垂直電泳槽

Biorad

164-8001

轉(zhuǎn)印槽

Biorad

Trans-Blot

脫色搖床

常州澳華

TY-80B

電泳儀

上海天能

EPS-200

低溫高速離心機(jī)

64R

BECKMAN

酶標(biāo)儀  

Thermo

Thermo Scientific Microplate Reader

 表格二:試劑

試劑名稱

廠家

PBS (0.01M, pH 7.4)

自配

Trizol

Life Technologies

Lv仿

國(guó)藥集團(tuán)

異丙醇

國(guó)藥集團(tuán)

乙醇

國(guó)藥集團(tuán)

PrimeScript® RT reagent Kit

Takara

熒光定量試劑盒

Takara

 

二、 實(shí)驗(yàn)步驟

1、樣本處理

4℃ 12000rpm 離心收集細(xì)胞,棄上清。PBS 清洗 1 遍后,加入 1mL Trizol 充分混勻。

2、兩相分離 每個(gè)樣品中加入 0.2 mL 的lv仿,蓋緊管蓋,劇烈振蕩管體,室溫靜置 5min。4℃下 12000rpm

離心 15 min。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lv仿相,中間層和上層的無(wú)色的水相。RNA 全部被分配于水相中。水相的體積大約是勻漿時(shí)加入的 Trizol 試劑的 60%。

3、RNA 沉淀 將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。加入等體積的異丙醇,水相與異丙醇混合以沉淀其中的 RNA?;靹虿⒃谑覝胤跤?10 min 后,4℃ 12000rpm 離心 10 min。

4、RNA 清洗 移去上清液,加入 1 mL 75%乙醇,清洗 RNA 沉淀。振蕩后,4℃ 7500 rpm 離心5 min。

5、重新溶解 RNA 沉淀

去除乙醇溶液,空氣中干燥 RNA 沉淀 5-10 min。溶解 RNA 時(shí),先加入無(wú) RNA 酶的水用槍反

復(fù)吹打幾次,然后 55 到 60℃孵育 10 min。獲得的 RNA 溶液保存于- 70℃。

6、反轉(zhuǎn)錄

1) 按下列組份配制 RT 反應(yīng)液

5×PrimeScript Buffer

5 μL

PrimeScript® RT Enzyme Mix I

1 μL

Oligo dT Primer(50 μM)×1

1 μL

Random 6 mers(100 μM)×1

1.5 μL

Total RNA

1 ng

RNase Free ddH2O

Up to 25 μL

2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下: 37℃ 15min,85℃ 5s。

3)反應(yīng)結(jié)束后,將其放在冰上待用或-20℃保存。

7、熒光定量 PCR

引物設(shè)計(jì)

Gene

Forward Primer

Reverse Primer

β-action

5′-TTCCAGCCCTCCTTCCTG-3′

5′-GCCCGACTCGTCATACTCC-3′

BCL

5′ -CTACCGTCGTGACTTCGC -3

3′-CCTATTGCCTCCGACCCT-5′

 

 

按下列組份配制 Realtime PCR 反應(yīng)體系

 

SYBR Premix Ex Taq

10 μL

PCR Forward Primer(10μM)

1 μL

PCR Reverse Primer(10μM)

1 μL

cDNA 模板

1 μL

ddH2O

7 μL

Total

Up to 20 μL

 

用漩渦振蕩器將管中溶液*混合均勻,短暫低速離心。

3)點(diǎn)樣。將混合好的液體加入孔板中,每個(gè)樣本的每個(gè)基因保證3個(gè)復(fù)孔,點(diǎn)完樣之后將 PCR 板置于離心機(jī)中 2000rpm、2min,然后用錫箔紙將板包好,置于 4 度冰箱中備用。 4) PCR 反應(yīng)

Real time PCR 儀使用 ABI7500,PCR 程序已優(yōu)化 將步驟 3 中已點(diǎn)好樣的 PCR 板置于 Realtime PCR 儀上進(jìn)行 PCR 反應(yīng):首先是預(yù)變形:95℃/10min

第二步是循環(huán)反應(yīng) 40 cycles : 95℃/15s; 60℃/45s(收集熒光) ;72℃/45s 第三步溶解曲線:95℃/15s; 60℃/1min ;95℃/15s

 

三、 結(jié)果與計(jì)算(采用 2 - △△ CT 法進(jìn)行分析)

基因相對(duì)表達(dá)量

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