143B/LUC細(xì)胞| 人骨肉瘤細(xì)胞帶熒光素酶培養(yǎng)步驟及其保種心得：
首先，細(xì)胞采購(gòu)的運(yùn)輸形式一般分為兩種，一種是直接寄送凍存細(xì)胞，一種是復(fù)蘇后寄送活細(xì)胞。前者是由液氮中取出細(xì)胞凍存管，采用干冰運(yùn)輸；后者是將細(xì)胞復(fù)蘇至T-25培養(yǎng)瓶中，采用常溫運(yùn)輸。兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)，di一種方式的優(yōu)點(diǎn)是可以長(zhǎng)途運(yùn)輸，因?yàn)榧?xì)胞在干冰中相對(duì)穩(wěn)定，一般可以保證數(shù)周之內(nèi)不影響細(xì)胞活性，但缺點(diǎn)是運(yùn)輸成本高，且細(xì)胞復(fù)蘇是很復(fù)雜的過(guò)程，如果細(xì)胞復(fù)蘇后狀態(tài)不佳，則很難界定是來(lái)源的問(wèn)題還是復(fù)蘇操作的問(wèn)題；而第二種方式的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞收到后可以直接通過(guò)觀察來(lái)大體了解細(xì)胞狀態(tài)，并且對(duì)運(yùn)輸?shù)囊笙鄬?duì)較低，缺點(diǎn)則是只適合短途運(yùn)輸，因?yàn)榧幢氵\(yùn)輸時(shí)培養(yǎng)基中不添加血清，細(xì)胞還是會(huì)不斷增殖，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后，細(xì)胞的狀態(tài)會(huì)隨時(shí)間的增加而不斷變差。綜上，如果是從國(guó)外大型細(xì)胞庫(kù)采購(gòu)，一般采用di一種方法，既能適應(yīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸，且大型細(xì)胞庫(kù)的凍存細(xì)胞質(zhì)量普遍較好，在良好的操作下復(fù)蘇成活率很高；如果是從國(guó)內(nèi)細(xì)胞庫(kù)采購(gòu)，則一般采用第二種方法，方便收到細(xì)胞時(shí)能較好掌握細(xì)胞狀態(tài)，并且降低運(yùn)輸成本。
細(xì)胞分別針對(duì)兩種運(yùn)輸方式來(lái)談下對(duì)新細(xì)胞的處理過(guò)程：
對(duì)于直接寄送凍存細(xì)胞的情況，首先要檢查的就是細(xì)胞收到后是否有足量剩余干冰，如果干冰不足，或是已經(jīng)沒(méi)有干冰，則細(xì)胞狀態(tài)可能會(huì)收到影響，建議盡快復(fù)蘇；如果有足量干冰，建議先轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱過(guò)夜，于第二天按正常流程復(fù)蘇，即37℃水浴鍋中快速融解，低速離心后去除含DMSO的凍存液，換入適合細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)基，輕柔吹勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，補(bǔ)足培養(yǎng)基；一般貼壁細(xì)胞在24h內(nèi)即可觀察到細(xì)胞貼壁，從而判斷細(xì)胞狀態(tài)，懸浮細(xì)胞則復(fù)蘇后即可觀察細(xì)胞狀態(tài)。對(duì)于凍存時(shí)間較長(zhǎng)的細(xì)胞，可能需要傳代1到2次后，細(xì)胞才會(huì)調(diào)整到正常狀態(tài)，所以細(xì)胞復(fù)蘇后如果狀態(tài)不佳，不要灰心，仍要細(xì)心培養(yǎng)。
對(duì)于復(fù)蘇后寄送活細(xì)胞的情況，則細(xì)胞收到后要先檢查細(xì)胞瓶是否有破損，細(xì)胞瓶在運(yùn)輸中很有可能受到碰撞和擠壓，導(dǎo)致瓶體受損。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞瓶受損，則需要盡快處理，該棄就棄。如果細(xì)胞瓶完好，則用酒精消毒瓶身，去除封口膜，然后置于37℃培養(yǎng)箱中靜置1-2h。待細(xì)胞穩(wěn)定后，觀察細(xì)胞狀態(tài)，并及時(shí)記錄，因?yàn)楹芏鄧?guó)內(nèi)細(xì)胞庫(kù)都是可以反饋細(xì)胞狀態(tài)的，如果收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)不佳甚至污染，是可以要求重新寄送的。細(xì)胞如沒(méi)有異常，則盡快傳代并更換適合細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)基。由于新細(xì)胞一般都是di一次接觸，細(xì)胞傳代過(guò)程中尤為需要注意胰酶消化時(shí)間，消化時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。我建議大家采用低濃度胰酶消化，消化時(shí)縮短放培養(yǎng)箱和觀察的間隔時(shí)間，以便盡可能找到合適的消化時(shí)間。
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：
1、培養(yǎng)瓶的包被：包被液如多聚賴(lài)氨酸（PLL，ScienCell品牌）或纖維粘連蛋白（BPF，ScienCell品牌），以無(wú)菌水稀釋至2 ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶。37度孵箱1小時(shí)或4度過(guò)夜，從包被好的培養(yǎng)瓶中回收多聚賴(lài)氨酸，并用無(wú)菌水洗滌培養(yǎng)瓶2遍。包被好的培養(yǎng)瓶不要放置超過(guò)24小時(shí)，其中的包被液可吸出重復(fù)使用2-3次，注意不要污染。
2、*培養(yǎng)基的配置：以內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM，ScienCell品牌）為例，把配套的胎牛血清（FBS，ScienCell品牌）、生長(zhǎng)因子（ECGS，ScienCell品牌）和雙抗（P/S，ScienCell品牌）加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液（ECM，ScienCell品牌）中。重新貼好標(biāo)簽，并混勻培養(yǎng)基。
二、原代細(xì)胞復(fù)蘇方法：
1、從液氮中取出原代細(xì)胞冷凍管，迅速投入37～38 ℃水浴中，其間可以輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞，加快融化速度，大約需要1分鐘時(shí)間。
2、5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)基稀釋至原體積的10倍以上，加入培養(yǎng)瓶中，再用1ml培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞凍存管，保證細(xì)胞都被加入培養(yǎng)瓶中，靜置于孵箱，12-16小時(shí)后更換培養(yǎng)基（除去DMSO）。以后每2天換一次液，保證細(xì)胞狀態(tài)良好。
三、原代細(xì)胞傳代方法：酶消化法
當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70-80%左右可以傳代，傳代比例以1:2或1:3為佳。具體方法如下：
1、棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，用PBS洗滌培養(yǎng)瓶2遍，加入0.25%的胰酶消化液（Trypsin-EDTA，ScienCell品牌，貨號(hào)0103），以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)。37度孵育4分鐘左右，輕拍培養(yǎng)瓶側(cè)面，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，直到80%細(xì)胞呈現(xiàn)圓形。
2、細(xì)胞消化好后，加入胰酶中和液（TNS，ScienCell品牌，貨號(hào)0113），并輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，形成細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞和培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘。
3、棄去上清液，以1-2ml新鮮培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞并吹打均勻，接種于包被好的新培養(yǎng)瓶中，瓶中已有10ml左右的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)基。

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