人白介素-33(IL-33)ELISA試劑盒

(用于血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其它生物體液內(nèi))

原理

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗人IL-33單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的IL-33與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人IL-33，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，后加終止液硫酸，在450nm處測(cè)OD值，IL-33濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IL-33濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）

酶標(biāo)板（CoatedWells）

96孔

酶標(biāo)抗體工作液（EnzymeConjugate）

12ml

10×標(biāo)本稀釋液（SampleBuffer）

12ml

20×濃縮洗滌液（WashBuffer）

50ml

標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）：20ng/瓶

2瓶

底物工作液（TMBSolution）

12ml

di一抗體工作液（BiotinylatedAntibody）

12ml

終止液（StopSolution）

12ml

準(zhǔn)備試劑與收集血樣

1.收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測(cè)，2-8℃保存48小時(shí)；更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍（-20℃或-70℃）保存，避免反復(fù)凍融。

2.標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成20ng/ml的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，di一管加標(biāo)本稀釋液900ul，第二至第八管加入標(biāo)本稀釋液500ul。在di一管中加入20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對(duì)照。

3.10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4.洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

檢測(cè)程序

1.加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。

2.洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。

3.每孔中加入di一抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應(yīng)15分鐘。

8.每孔加入100ul終止液混勻。

9.30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

人白介素-33(IL-33)ELISA試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體含量。
液體類標(biāo)本：
包括血清，血漿，尿液，胸腹水，腦脊液，細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中如有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，在離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
尿液：
用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右，通過反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并釋放細(xì)胞內(nèi)的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后，稱取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?，?biāo)本融化后仍保持2-8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，分裝后留一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

結(jié)果計(jì)算與判斷

1.所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。

2.以標(biāo)準(zhǔn)品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)IL-33含量。

試劑盒性能

1.靈敏度：小的IL-33檢測(cè)濃度小于15pg/ml。

2.特異性：可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人IL-33。不與人其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。

3.重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于10％。

注意事項(xiàng)

1.以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品均建議做復(fù)孔，每次測(cè)定應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高。

3.板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

4.本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

5.本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！