萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒研究

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿樣、組織、飼料等樣本中的萊克多巴胺（Ractopamine，RAC），試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的萊克多巴胺和酶標板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗萊克多巴胺抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含萊克多巴胺含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中萊克多巴胺的殘留量。

2 技術(shù)指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

尿液……………………………0.1ppb

組織（處理方法一）……………0.4ppb

肌肉（處理方法二）……………0.1ppb

肝臟（處理方法二）……………0.2ppb

飼料……………………………1ppb

2.4 交叉反應率：

萊克多巴胺 …………………… 100%

多巴酚丁胺………………………< 1%

克倫特羅…………………………<0.1%

沙丁胺醇…………………………<0.1%

 2.5 樣本回收率：

尿樣……………………………95%±10%

組織、飼料……………………90%±15%

3 試劑盒組成

酶標板……………………………96孔

標準液：各1ml

0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

高標準液（紅蓋）：100ppb………1ml

酶標記物（紅蓋）…………………5.5ml

抗體工作液（藍蓋）………………9ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

10X復溶液(黃蓋)…………………50ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：正己烷、乙腈、甲醇、無水硫酸鈉 

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：復溶液

    將10×復溶液用去離子水10倍稀釋，用于樣本的復溶，復溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 尿樣處理方法：

    直接取20µl清亮尿樣進行測定（渾濁尿樣需要過濾或經(jīng)4000r/min離心5min，以得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。

尿樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.1ppb

5.3.2 組織樣本處理方法一：

   稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入6ml復溶液，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min (若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。取20µl上清液進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：0.4ppb

5.3.3 組織樣本（肌肉和肝臟）處理方法二：

1）稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ，加入8ml乙腈溶液，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min。

2）取上清液5ml，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥；

▲肌肉樣本：

    加入1ml 復溶液混合振蕩30s，取20µl用于分析。

肌肉樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.1ppb

▲肝臟樣本：

    加入2ml正己烷振蕩溶解，再加入1ml 去離子水混合振蕩30s，室溫4000r/min以上離心5min，去除上層；取50µl下層與50µl復溶液混勻；取20µl用于分析。

肝樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：0.2ppb

5.3.4 飼料樣本處理方法：

1）稱取均質(zhì)后的飼料樣品1.0±0.05g，加入10ml甲醇，再加入5g無水硫酸鈉，振蕩2min；室溫 4000r/min以上離心10min；

2）吸出離心后的上清液1ml，于56℃氮氣吹干，用1 ml復溶液溶解干燥的殘留物，再加入1mL正己烷混合30s；室溫4000r/min以上離心5min。

3）取20µl下層進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：1ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品或樣本20µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入80µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。